【摘 要】
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苯乳酸是一种新型有机酸,具有抑菌谱广、安全性高、可提高免疫力等优点,在食品防腐中具有较高应用潜力。苯乳酸可由乳酸菌代谢产生,且前期研究发现苯乳酸与乳酸共存时,抑菌活性会增强。因此,本研究以蜡样芽孢杆菌作为指示菌,考察苯乳酸与乳酸的协同抑菌性,以期为苯乳酸在食品防腐中的应用和拮抗乳酸菌的筛选提供参考。首先,研究了苯乳酸与乳酸对蜡样芽孢杆菌的联合抑菌效应及抑菌靶位。采用二倍稀释法考察了苯乳酸和乳酸对蜡
【基金项目】
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河北省杰出青年基金C2016208142；
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苯乳酸是一种新型有机酸,具有抑菌谱广、安全性高、可提高免疫力等优点,在食品防腐中具有较高应用潜力。苯乳酸可由乳酸菌代谢产生,且前期研究发现苯乳酸与乳酸共存时,抑菌活性会增强。因此,本研究以蜡样芽孢杆菌作为指示菌,考察苯乳酸与乳酸的协同抑菌性,以期为苯乳酸在食品防腐中的应用和拮抗乳酸菌的筛选提供参考。首先,研究了苯乳酸与乳酸对蜡样芽孢杆菌的联合抑菌效应及抑菌靶位。采用二倍稀释法考察了苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌的最小抑菌浓度;联合抑菌指数法与时间-杀菌曲线评价了苯乳酸与乳酸的联合抑菌效应;从膜电势、细胞膜完整性、细胞形态结构等方面分析了苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌的抑菌靶位。结果表明:苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）分别为1.25、0.625 mg/m L,苯乳酸与乳酸组合的部分抑菌浓度指数为0.75,表明了苯乳酸与乳酸对蜡样芽孢杆菌具有协同抑制效应。采用Di SC3（5）荧光探针标记考察膜电势的变化,1/4MIC苯乳酸、1/2MIC乳酸及1/4MIC苯乳酸+1/2MIC乳酸联用组处理后,荧光强度分别为784、797.2、853,表明苯乳酸、乳酸消散了膜电势,而苯乳酸和乳酸联用则协同增强了损伤程度;通过荧光探针SYTO9/PI标记考察膜完整性,结果显示1/4MIC苯乳酸、1/2MIC乳酸及联用组PI沾染率分别为68%、79.4%、97.5%,表明苯乳酸与乳酸可以协同破坏细胞膜完整性;采用扫描电镜和透射电镜考察形态结构损伤,表明经过苯乳酸、乳酸处理后,蜡样芽孢杆菌菌体变形、细胞膜模糊、细胞质密度降低。其次,考察了苯乳酸和乳酸联用对蛋白质组的影响。采用蛋白质电泳考察了苯乳酸、乳酸对蛋白质的影响,表明苯乳酸、乳酸干扰蛋白质合成从而对蜡样芽孢杆菌发挥抑菌作用。基于iTRAQ技术研究了苯乳酸与乳酸联用对蜡样芽孢杆菌的协同抑菌机理。经蛋白质组学分析,MIC苯乳酸、MIC乳酸、1/4MIC苯乳酸+1/2MIC乳酸组差异表达蛋白数量分别为:30个（19个上调蛋白,11个下调蛋白）、125个（70个上调蛋白,55个下调蛋白）、35个（17个上调蛋白,18个下调蛋白）。在分子功能及细胞成分的影响中,MIC苯乳酸、MIC乳酸、1/4MIC苯乳酸+1/2MIC乳酸组对离子键合、细胞质影响最大。基于蛋白质组学结果通过生物信息学分析了苯乳酸与乳酸对蜡样芽孢杆菌代谢通路的影响,结果显示:苯乳酸通过抑制钾离子转运、干扰核糖体功能等发挥抑菌作用;乳酸通过干扰核糖体功能、TCA循环、磷转运以及嘌呤和嘧啶的代谢,并调节毒力因子的表达从而导致细胞死亡;苯乳酸和乳酸联用通过抑制钾离子及磷转运,并影响核糖体、嘌呤和嘧啶的合成从而发挥抑菌作用。最后,研究了苯乳酸与乳酸对蜡样芽孢杆菌芽孢的抑菌活性及抑菌机理。通过二倍稀释法考察了苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌芽孢的最小抑芽孢浓度分别为1.25、0.5 mg/mL,部分抑芽孢浓度指数为0.75;采用MTT法考察了苯乳酸、乳酸对芽孢氧化代谢的影响,结果表明作用60 min后MIC苯乳酸、MIC乳酸及联用组对芽孢氧化代谢产生抑制作用且联用组显示出协同抑制作用;通过PI沾染结合流式细胞术考察了苯乳酸和乳酸对芽孢膜完整性的影响,作用120 min后,所有组别PI的沾染率均在35%以下,但联用组仍然对芽孢膜的破坏展现出协同抑制作用;通过荧光染料DIOC2染色分析了苯乳酸和乳酸对芽孢膜电位的影响,结果显示MIC苯乳酸、MIC乳酸及联用组处理后,芽孢荧光强度明显降低,表明苯乳酸、乳酸在芽孢萌发后通过消散膜电位抑制芽孢。
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