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在过去的三十年里，威胁生命的侵袭性真菌感染在免疫抑制或免疫缺陷患者中的发病率越来越高。临床上最常见的侵袭性真菌主要是白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉菌。全球每年因为侵袭性真菌感染导致的死亡人数超过160万人。
目前，治疗侵袭性真菌感染的药物主要包括唑类、多烯类、氟胞嘧啶和棘白菌素类。其中唑类药物作为临床一线抗真菌药物被广泛使用，其作用机制是通过抑制羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)阻断麦角甾醇的合成，影响真菌细胞膜的完整性，从而导致真菌死亡。虽然唑类药物作为临床治疗侵袭性真菌感染的首选药物，但是现有药物在广谱性、安全性和耐药性方面仍面临很多问题。例如，氟康唑主要用于治疗念珠菌感染，对曲霉菌无效。伏立康唑主要用于治疗肺部曲霉菌感染，对新生隐球菌疗效较差。而伊曲康唑和泊沙康唑对人CYP3A4强抑制作用和较差的生物利用度限制了它们的临床应用。此外，真菌对唑类药物的耐药性最为严重和普遍。因此，临床上迫切需要广谱、高效、低毒、抗耐药的抗真菌药物。
本课题以新型氮唑类抗真菌药物为研究方向，研究内容大致分为4个阶段，前三个阶段以化合物设计、合成和体外活性研究为主，后一个阶段以动物药效评价筛选、初步毒性、初步药代和作用机制研究为主。各阶段中运用的化合物设计合成技术主要包括:基于唑类药物的构效关系和靶酶信息开展化合物的设计;基于全新合成策略进行目标化合物设计与合成;基于不同研究阶段的构效关系指导的化合物设计。
作为在第一阶段的探索，利用含炔中间体和芳基叠氮，通过click反应，合成了具有1，2，3-三氮唑侧链的A类化合物(6A1-12)，此类化合物为含有一个手性中心的消旋体。体外活性结果表明部分A类化合物对白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉菌均有较好的抑制活性，表现了一定的广谱抗真菌活性，这一阶段初步探索了1，2，3-三氮唑侧链的重要性。
在第二阶段的研究是基于A类化合物1，2，3-三氮唑的侧链结构，再增加一个手性中心，设计合成了由手性叔醇和含甲基手性碳构成的双手性中心碳链的B类手性化合物(12B1-33和14B1-6)，活性得以进一步的提升，获得了一批体外活性高、抗真菌谱广的化合物。随后，将B类化合物的1，2，3-三氮唑替换成异噁唑得到D类化合物(22D1-21)，另外，将A类化合物的1，2，3-三氮唑替换成吡唑获得侧链较长的F类化合物(30F、31F、28F1-5和33F1-22)。体外筛选结果表明，含有1，2，3-三氮唑侧链化合物体外抗真菌活性最强，异噁唑次之，吡唑最弱，提示具有1，2，3-三氮唑类侧链与手性链相连的结构值得深入研究。
第三阶段的研究中，将B和D类化合物中的2，4-二氟苯基用2，5-二氟苯基替换，分别得到化合物12B34-36和22D22-29，抗真菌谱和抗真菌活性研究表明，2，4-二氟苯基类化合物优于2，5-二氟苯基类化合物。将A类化合物的叔醇结构用手性四氢呋喃环替换，得到C类化合物(18C1-11)和E类化合物(23E)。含有手性甲基叔醇片段的化合物(B类和D类)显著优于消旋体化合物(A类和F类)和手性四氢呋喃环结构的化合物(C类和E类)。提示手性甲基叔醇片段对此类化合物的抗真菌谱和活性的重要性。
综合这三个阶段，建立了以(2R, 3S)-2-(2，4-二氟苯基)-3-甲基-1-(1H-1，2，4-三氮唑-1-基)-4-戊炔-2-醇(11a)为关键中间体的新化合物合成策略，根据前期研究结果和最新报道的CYP51结构信息，设计合成并筛选了6类共计124个化合物，均为首次报道。所有化合物均经1HNMR和LC-MS表征，部分化合物经13CNMR确认。获得了一批对三种致病真菌抑制活性较高的化合物，此类化合物的特征为含有中等长度的侧链，并获得了新的构效关系:1)侧链末端芳环引入强吸电子基团和亲水性基团不利于抗真菌活性，而卤素取代有利于抗真菌谱，尤其是在侧链苯环的邻位引入氟原子可以显著提高抗烟曲霉菌的活性，分子对接结果表明，邻位氟原子可以与CYP51的Tyr122残基形成氢键;2)对于吡唑类侧链，侧链末端存在氢键受体或供体有利于抗真菌活性，其中，含有4-氰基苄氧基的化合物28F1活性最高，分子对接表明，4-氰基与Lys90和苄氧基与His377形成的氢键可能是其活性较好的原因。
第四阶段，分别开展动物药效、初步毒性、初步药代和作用机制研究。
首先，优选体外活性高的22D20开展动物药效评价。在小鼠白念珠菌SC5314系统性感染模型中，化合物22D20的给药剂量为2mg/kg，没有显示出对小鼠的保护作用并且显著弱于氟康唑。推测体内药效较差的原因可能与化合物的代谢稳定性有关。
随后，从D类化合物中选出4个不同取代基的化合物22D1、22D2、22D9和22D20开展体外小鼠肝微粒体酶稳定性筛选，结果表明化合物的对位取代基能够提高化合物的代谢稳定性，取代基稳定性顺序为-OCF3＞-Cl＞-H＞-F。
基于代谢稳定性筛选结果，选取12B4、12B5、12B27、12B28、22D1、22D9和28F1等7个化合物，开展在小鼠白念珠菌SC5314系统性感染模型中的药效评价。筛选结果表明，化合物12B4、12B5、12B27、12B28、22D1、22D9和28F1的体内药效与基团代谢稳定性一致，除化合物12B4外，均显示出优于或相当于氟康唑的体内活性。
优选其中的12B5和22D9开展了其他菌种的动物药效筛选，结果表明:化合物12B5具有广谱抗真菌活性，对新生隐球菌H99体内药效显著优于氟康唑，对烟曲霉菌7544的活性与伏立康唑相当。而22D9在小鼠感染模型中只对白念珠菌SC5314和新生隐球菌H99有效，对烟曲霉菌基本无效，虽然广谱性不如12B5，但是22D9在低剂量下对新生隐球菌H99的作用显著优于氟康唑。
针对真菌耐药问题，我们也考察了化合物12B5对白念珠菌临床耐药株100的体内药效评价，结果显示在0.5mg/kg给药剂量下，氟康唑和伏立康唑与对照组没有显著性差异，而12B5可以显著延长小鼠的平均生存时间。
最后，作用机制研究表明12B5与其它唑类药物一样，均作用于CYP51影响真菌麦角甾醇合成通路。亚急性毒性实验表明12B5的安全性优于伏立康唑，大鼠体内的药代动力学数据显示12B5具有良好的半衰期和口服生物利用度。
综上所述，通过四个阶段的研究，筛选获得结构新颖、安全性更高、可口服的广谱抗真菌三氮唑类化合物12B5，尤其是对白念珠菌、临床耐药白念珠菌和新生隐球菌的体内药效显著优于氟康唑和伏立康唑。因此，12B5将作为候选分子开展进一步研究。
目前，治疗侵袭性真菌感染的药物主要包括唑类、多烯类、氟胞嘧啶和棘白菌素类。其中唑类药物作为临床一线抗真菌药物被广泛使用，其作用机制是通过抑制羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)阻断麦角甾醇的合成，影响真菌细胞膜的完整性，从而导致真菌死亡。虽然唑类药物作为临床治疗侵袭性真菌感染的首选药物，但是现有药物在广谱性、安全性和耐药性方面仍面临很多问题。例如，氟康唑主要用于治疗念珠菌感染，对曲霉菌无效。伏立康唑主要用于治疗肺部曲霉菌感染，对新生隐球菌疗效较差。而伊曲康唑和泊沙康唑对人CYP3A4强抑制作用和较差的生物利用度限制了它们的临床应用。此外，真菌对唑类药物的耐药性最为严重和普遍。因此，临床上迫切需要广谱、高效、低毒、抗耐药的抗真菌药物。
本课题以新型氮唑类抗真菌药物为研究方向，研究内容大致分为4个阶段，前三个阶段以化合物设计、合成和体外活性研究为主，后一个阶段以动物药效评价筛选、初步毒性、初步药代和作用机制研究为主。各阶段中运用的化合物设计合成技术主要包括:基于唑类药物的构效关系和靶酶信息开展化合物的设计;基于全新合成策略进行目标化合物设计与合成;基于不同研究阶段的构效关系指导的化合物设计。
作为在第一阶段的探索，利用含炔中间体和芳基叠氮，通过click反应，合成了具有1，2，3-三氮唑侧链的A类化合物(6A1-12)，此类化合物为含有一个手性中心的消旋体。体外活性结果表明部分A类化合物对白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉菌均有较好的抑制活性，表现了一定的广谱抗真菌活性，这一阶段初步探索了1，2，3-三氮唑侧链的重要性。
在第二阶段的研究是基于A类化合物1，2，3-三氮唑的侧链结构，再增加一个手性中心，设计合成了由手性叔醇和含甲基手性碳构成的双手性中心碳链的B类手性化合物(12B1-33和14B1-6)，活性得以进一步的提升，获得了一批体外活性高、抗真菌谱广的化合物。随后，将B类化合物的1，2，3-三氮唑替换成异噁唑得到D类化合物(22D1-21)，另外，将A类化合物的1，2，3-三氮唑替换成吡唑获得侧链较长的F类化合物(30F、31F、28F1-5和33F1-22)。体外筛选结果表明，含有1，2，3-三氮唑侧链化合物体外抗真菌活性最强，异噁唑次之，吡唑最弱，提示具有1，2，3-三氮唑类侧链与手性链相连的结构值得深入研究。
第三阶段的研究中，将B和D类化合物中的2，4-二氟苯基用2，5-二氟苯基替换，分别得到化合物12B34-36和22D22-29，抗真菌谱和抗真菌活性研究表明，2，4-二氟苯基类化合物优于2，5-二氟苯基类化合物。将A类化合物的叔醇结构用手性四氢呋喃环替换，得到C类化合物(18C1-11)和E类化合物(23E)。含有手性甲基叔醇片段的化合物(B类和D类)显著优于消旋体化合物(A类和F类)和手性四氢呋喃环结构的化合物(C类和E类)。提示手性甲基叔醇片段对此类化合物的抗真菌谱和活性的重要性。
综合这三个阶段，建立了以(2R, 3S)-2-(2，4-二氟苯基)-3-甲基-1-(1H-1，2，4-三氮唑-1-基)-4-戊炔-2-醇(11a)为关键中间体的新化合物合成策略，根据前期研究结果和最新报道的CYP51结构信息，设计合成并筛选了6类共计124个化合物，均为首次报道。所有化合物均经1HNMR和LC-MS表征，部分化合物经13CNMR确认。获得了一批对三种致病真菌抑制活性较高的化合物，此类化合物的特征为含有中等长度的侧链，并获得了新的构效关系:1)侧链末端芳环引入强吸电子基团和亲水性基团不利于抗真菌活性，而卤素取代有利于抗真菌谱，尤其是在侧链苯环的邻位引入氟原子可以显著提高抗烟曲霉菌的活性，分子对接结果表明，邻位氟原子可以与CYP51的Tyr122残基形成氢键;2)对于吡唑类侧链，侧链末端存在氢键受体或供体有利于抗真菌活性，其中，含有4-氰基苄氧基的化合物28F1活性最高，分子对接表明，4-氰基与Lys90和苄氧基与His377形成的氢键可能是其活性较好的原因。
第四阶段，分别开展动物药效、初步毒性、初步药代和作用机制研究。
首先，优选体外活性高的22D20开展动物药效评价。在小鼠白念珠菌SC5314系统性感染模型中，化合物22D20的给药剂量为2mg/kg，没有显示出对小鼠的保护作用并且显著弱于氟康唑。推测体内药效较差的原因可能与化合物的代谢稳定性有关。
随后，从D类化合物中选出4个不同取代基的化合物22D1、22D2、22D9和22D20开展体外小鼠肝微粒体酶稳定性筛选，结果表明化合物的对位取代基能够提高化合物的代谢稳定性，取代基稳定性顺序为-OCF3＞-Cl＞-H＞-F。
基于代谢稳定性筛选结果，选取12B4、12B5、12B27、12B28、22D1、22D9和28F1等7个化合物，开展在小鼠白念珠菌SC5314系统性感染模型中的药效评价。筛选结果表明，化合物12B4、12B5、12B27、12B28、22D1、22D9和28F1的体内药效与基团代谢稳定性一致，除化合物12B4外，均显示出优于或相当于氟康唑的体内活性。
优选其中的12B5和22D9开展了其他菌种的动物药效筛选，结果表明:化合物12B5具有广谱抗真菌活性，对新生隐球菌H99体内药效显著优于氟康唑，对烟曲霉菌7544的活性与伏立康唑相当。而22D9在小鼠感染模型中只对白念珠菌SC5314和新生隐球菌H99有效，对烟曲霉菌基本无效，虽然广谱性不如12B5，但是22D9在低剂量下对新生隐球菌H99的作用显著优于氟康唑。
针对真菌耐药问题，我们也考察了化合物12B5对白念珠菌临床耐药株100的体内药效评价，结果显示在0.5mg/kg给药剂量下，氟康唑和伏立康唑与对照组没有显著性差异，而12B5可以显著延长小鼠的平均生存时间。
最后，作用机制研究表明12B5与其它唑类药物一样，均作用于CYP51影响真菌麦角甾醇合成通路。亚急性毒性实验表明12B5的安全性优于伏立康唑，大鼠体内的药代动力学数据显示12B5具有良好的半衰期和口服生物利用度。
综上所述，通过四个阶段的研究，筛选获得结构新颖、安全性更高、可口服的广谱抗真菌三氮唑类化合物12B5，尤其是对白念珠菌、临床耐药白念珠菌和新生隐球菌的体内药效显著优于氟康唑和伏立康唑。因此，12B5将作为候选分子开展进一步研究。