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目的通过研究C/EBPδ在角膜缘上皮细胞增殖分化过程中表达和调控,探索角膜缘上皮细胞增殖分化调控机制及特异性蛋白标志表达。方法:1.获取鼠的角膜及角膜缘组织,制备冰冻切片,对中央角膜、角膜缘组织及体外培养的人角膜缘上皮细胞SDHCEC进行免疫荧光染色检测中央角膜及角膜缘部位角蛋白3(CK3)、CCAAT区/增强子结合蛋白δ(C/EBPδ)、细胞周期依赖性激酶抑制剂P27蛋白的表达及定位。2.将重组的人TGF-β1分别按照0、0.5、1、3、5ng/ml不同的浓度加入到人角膜缘上皮细胞的培养液中,分别孵育12h、24h及48h,用MTT法绘制细胞的生长增殖曲线,流式细胞仪分析细胞周期,绘制细胞周期曲线,检测不同浓度的TGF-β1对角膜缘上皮细胞的增殖分化作用。3.构建人C/EBPδcDNA克隆的真核表达载体pEGFP-C1-C/EBPδ,用此质粒与转染试剂Lipofectamine的不同浓度组合,分别转染角膜缘上皮细胞,12h、24h及48h后在荧光倒置显微镜下观察转染效率,对转染条件进行优化。4.采用质粒pEGFP-C1-C/EBP 6在优化后的转染条件下对角膜缘上皮细胞进行转染,24h后加入TGF-β1作用,并分别于作用的不同时间收集细胞,实时荧光定量PCR法检测C/EBPδmRNA的表达。结果:1.免疫荧光染色显示:CK3表达于除角膜缘基底细胞以外的角膜及角膜缘表层细胞胞质:C/EBPδ着染于角膜缘基底细胞胞核;P27表达于角膜缘基底细胞的胞浆或胞核。2.TGF-β1对人的角膜缘上皮细胞增殖的影响:0、0.5、1、3、5ng/ml TGF-β1作用于角膜缘上皮细胞12、24和48h后,利用酶联免疫检测仪测定490nm波长时各孔光吸收值,绘制生长曲线图,1ng/ml的TGF-β1作用48h后细胞增殖受到明显的抑制:分别于1ng/ml的TGF-β1作用角膜缘上皮细胞12h、24h和48h后收集细胞,流式细胞仪分析细胞的DNA含量检测细胞周期,TGF-β1作用24h后细胞分化明显。3.试验结果显示:增加DNA的量可以提高转染效率,对于6孔板Lipofectamine的剂量≤15ul时转染复合物的细胞毒性较小,细胞的存活率可达到80%以上,但是当Lipofectamine的剂量增加至17.5μl时,其细胞毒性显著增加。在转染复合物为4.0ug与10.0μ1时转染效率最高达85%,并且仍能保证80%的细胞存活率。4.荧光定量PCR的结果显示:与正常组比较,转染24h后(即加入TGF-β1前),C/EBPδ基因转染组与TGF-β1+C/EBPδ组C/EBPδmRNA的表达明显增加,加入TGF-β1后TGF-β1组C/EBPδmRNA明显减少,TGF-β1+C/EBPδ组虽减少但仍高于正常细胞水平。结论:1.C/EBPδ可作为角膜缘上皮细胞分化标记,联合其他的标记物用于识别角膜缘上皮细胞。2.TGF-β1作用于角膜缘上皮细胞可抑制角膜缘上皮细胞的克隆增殖,刺激分化,可用于探讨作用因素引起角膜缘上皮细胞增殖分化的作用机制。3.优化转染条件,转染试剂Lipofectamine能将重组的基因克隆质粒高效地转染进角膜缘上皮细胞,为临床中应用角膜缘上皮细胞进行基因治疗开拓新的思路。4.自行构建的C/EBPδ基因质粒转染角膜缘上皮细胞,通过荧光定量PCR检测研究C/EBPδ基因在调节角膜缘上皮细胞增殖分化中作用机制,为临床应用角膜缘上皮细胞提供依据。