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百合是世界著名的观赏花卉之一,不同种类品种的百合花香存在很大差异。本试验以萜类物质挥发性量明显不同的几种百合为材料,通过采用RT-PCR、RACE和hiTAIL-PCR技术,在百合花瓣中克隆到萜类代谢途径关键酶--1-脱氧木糖-5-磷酸还原酶(DXR)基因,并对其进行了表达分析和功能验证。结果如下:
1.不同种类和品种百合在盛开期香气中的萜类物质含量不同且与花香有密切关系。采用固相微萃取和GC-MS测定的挥发性萜类物质总量,分析结果表明萜类挥发量‘西伯利亚’＞‘元帅’＞‘黄天霸’＞‘铁炮’＞‘布鲁诺’,与人的嗅觉感受一致。从香气中的萜类物质成分和含量来看,在‘西伯利亚’、‘元帅’和‘黄天霸’中,3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯和L-芳樟醇含量是主要挥发性成分,而‘铁炮’中,则是反式罗勒烯挥发量最高。‘西伯利亚’和‘铁炮’百合不同花期的萜类物质香气的变化来看,花蕾期和初开期萜类物质挥发量少,盛开期萜类物质挥发量最高,凋谢期又降低,萜类物质含量的变化与嗅觉感受的香气变化成正比。
2.利用RT-PCR-及RT-PCR基础上的RACE技术克隆出了‘铁炮’百合花瓣中的Ll-DXR的cDNA全长。采用RT-PCR扩增出基因片段、RACE技术扩增出基因3端以及hiTAIL-PCR扩增5端,经过序列拼接,克隆出了‘布鲁诺’百合花瓣中的La-DXR的cDNA全长。Ll-DXR的cDNA全长核苷酸序列为1606 bp,其中5端非编码区长33bp,3端非编码长154 bp,读码框为1419 bp,推导的氨基酸序列含472个氨基酸。La-DXR全长核苷酸序列为2142 bp,其中5端非编码区长540bp,3端非编码长183bp,读码框为1419 bp,推导的氨基酸序列含472个氨基酸。Ll-DX-R、La-DXR推导的氨基酸预测分子量Mw为51.3kD,理论等电点pI为6.04。Ll-DXR、La-DXR翻译区核苷酸序列同源性达98％,但是在5和3非翻译区差异极显著。Ll-DXR、La-DXR编码氨基酸序列与其它植物DXR基因有较高的同源性,具有其他植物DXR基因所共有的NADPH结合位点,植物DXR结合位点,脯氨酸富集区。
3.Southern杂交结果显示,Ll-DXR在‘铁炮’百合基因组中是单拷贝基因。Northern杂交结果显示,Ll-DXR在有香气的‘西伯利亚’、‘元帅’、‘黄天霸’和‘铁炮’百合植株花瓣、雄蕊、雌蕊、叶片、茎轴、鳞茎和根中均有表达,且在盛开期时花瓣中的表达强于植株的其他部位;Ll-DXR基因在无香气的亚洲百合‘布鲁诺’的各部位都不表达;‘西伯利亚’和‘铁炮’花蕾期表达微弱,初开期和盛开期表达强烈,在凋谢期基因表达减弱。
La-DXR在‘西伯利亚’、‘元帅’、‘黄天霸’、‘铁炮’和‘布鲁诺’百合的花瓣中都有表达,其表达量也没有明显差异。
4.构建了Ll-DXR原核表达载体pET-30a(+)-DXR,由表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒在大肠杆菌中诱导表达,得到不溶性的目的蛋白。
5.构建了Ll-DXR的植物超表达载体pOx-DXR,用农杆菌侵染法转化烟草,通过PCR和Southern杂交验证获得了转基因植株。Ll-DXR基因超表达的转基因烟草中,叶片中的茄酮的含量有所增加,比野生型烟草的含量增加30％以上;花中大多萜类物质如反式石竹烯、芳樟醇、葎草烯等含量有所降低,芳樟醇含量减少60％以上,葎草烯含量减少70％以上,其中反式石竹烯含量减少80％以上,变化十分显著;叶片中的植物醇消失,生成新植二烯,并且含量较高,是野生型烟草的植物醇的19倍以上;花中还产生了一种新的萜类物质--2-癸烯醛。
6.通过百合花器官--子房诱导愈伤组织,建立起‘西伯利亚’和‘布鲁诺’百合的遗传转化体系。将子房诱导增殖形成的带生长点鳞茎盘作为受体,用含有pOX-DXR质粒的农杆菌侵染,经PCR检测和回收测序证实获得13株转基因‘布鲁诺’百合植株和1株‘西伯利亚’百合植株。经GC-MS测定,转基因百合‘布鲁诺’叶片中,仅有的萜类物质--癸醛含量减少,新生成了4-(甲氧基环十二烷)吗啉和2,4,5-三甲基二苯基甲烷,其它烷类、酮类、醛类物质均比野生型的植株叶片有所降低。