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目的:本课题组前期从中药鹅不食草中得到一种活性单体成分心菊内酯(Helenalin),本研究拟以NF-κB和PI3K/Akt信号通路为切入点,探讨Helenalin体外抗肝纤维化的作用及其机制。方法:选择HSC-T6、LX-2和L02细胞作为本实验观察对象。将HSC-T6、LX-2细胞分成6组:正常组、模型组(20 ng/mLIL-1β)、阳性药组(20 μmol/L LY294002)、Helenalin 高、中、低剂量组(2、1、0.5 μmol/L Helenalin);L02细胞分成4组:正常组、Helenalin高、中、低剂量组(2、1、0.5 μmol/L Helenalin)。20 ng/mL IL-1β刺激HSCs 30 min使其增殖活化,随后加入Helenalin干预24 h,随后进行以下实验:(1)Helenalin对细胞增殖、迁移和集落形成的影响MTT法检测Helenalin对HSCs增殖的影响;试剂盒检测Helenalin对HSCs培养基上清中AST、ALT和LDH含量的影响;划痕实验观察Helenalin对细胞迁移的影响;集落形成实验观察Helenalin对细胞集落形成的影响。(2)Helenalin对炎症因子的影响ELISA试剂盒检测Helenalin对HSCs内IL-6和TNF-α等炎症因子的影响。此外,Western blot检测HSCs内IL-6、TGF-β1和TNF-α等炎症相关蛋白的表达情况,观察Helenalin对HSCs内炎症水平的影响。(3)Helenalin对细胞凋亡的影响AO/EB荧光染色实验、流式细胞术观察Helenalin对HSCs细胞凋亡的影响。同时,Western blot检测HSCs内Bax、Bcl-2和Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达。(4)Helenalin对胶原的影响Western blot 检测 HSCs 内 α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、MMP-9和TIMP-1等胶原相关蛋白的表达,观察Helenalin对胶原以及MMPs/TIMPs的影响。(5)Helenalin对NF-κB信号通路的影响Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白的表达及磷酸化水平,通路蛋白包括:TLR4、MyD88、NF-KB p65、IKKα、IκBα p-p65 和 p-IKKα。RT-PCR检测NF-κB p65 mRNA的表达情况。观察Helenalin对NF-κB信号通路的影响。(6)Helenalin对PI3K/Akt信号通路的影响Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达及磷酸化水平,通路相关蛋白包括:PI3K、Akt、mTOR、P70S6K、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K 和 PTEN。RT-PCR 检测 PI3K、Akt、mTOR 和 P70S6K mRNA 的表达。观察Helenalin对PI3K/Akt信号通路的影响。(7)Helenalin 对 miR-200a/TLR4 表达的影响选择 HSC-T6 细胞,加入 20 ng/mL IL-1β 刺激 24 h,RT-PCR 检测 HSC-T6细胞中miR-200a表达情况。随后,使用Lipofectamine 2000将不同浓度的miR-200amimics(20、40、60、80 和 l00μM)转染至 HSC-T6 细胞内,选择最适转染浓度。随后实验设6组:正常组、NC组(转染miR-200a NC)、miR-200aup 组(转染 miR-200amimics)、Helenalin 高、中、低剂量组(2、1、0.5 μmol/L),Western blot 检测过表达 miR-200a 的 HSC-T6 内 TLR4 蛋白表达情况。结果:(1)Helenalin抑制细胞增殖、迁移和集落形成实验发现,IL-1β刺激明显促进HSC-T6和LX-2细胞增殖(P<0.01),Helenalin干预显著抑制活化的HSC-T6和LX-2细胞增殖,呈现浓度依赖性(P<0.01);Helenalin高剂量同样也能够抑制L02细胞活性。类似的,IL-1β刺激显著增加HSC-T6和LX-2细胞培养基上清中AST和ALT含量、促进细胞迁移和集落形成(P<0.01);使用Helenalin进行干预后,显著减少上清中AST和ALT含量、促进LDH释放、抑制细胞迁移和集落形成(P<0.01或P<0.05);而Helenalin对LO2细胞培养基上清中AST、ALT和LDH的含量无较明显的影响。以上结果表明,Helenalin能够显著抑制HSCs增殖活化、迁移和集落形成。(2)Helenalin减轻HSCs内炎症因子释放ELISA试剂盒结果表明,IL-1β刺激显著增加HSC-T6细胞内IL-6和TNF-α的含量(P<0.01)。Helenalin干预显著减轻IL-1β刺激引起的细胞内IL-6和TNF-α含量的异常升高(P<0.01)。类似的,Western blot结果显示,IL-Ⅰβ刺激显著升高HSC-T6细胞内IL-6、TGF-β1和TNF-α蛋白的表达(P<0.01);Helenalin干预显著抑制IL-6、TGF-β1和TNF-α蛋白的表达。提示,Helenalin能够通过抑制炎症相关蛋白的表达,减轻炎症反应,从而抑制HSCs活化。(3)Helenalin 促进 HSCs 凋亡AO/EB荧光染色实验和流式细胞术检测结果均发现,Helenalin显著诱导 HSC-T6 和 LX-2 细胞凋亡(P<0.01 或 P<0.05)。进一步通过 Western blot检测凋亡相关蛋白表达,实验发现,IL-1β刺激显著上调HSC-T6细胞Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达,并下调Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达(P<0.01或P<0.05);Helenalin干预显著抑制Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达,并促进Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达(P<0.01或P<0.05)。上述结果表明,Helenalin能够通过调控凋亡相关蛋白的表达,促进HSCs凋亡。(4)Helenalin改善胶原沉积Western blot结果显示,IL-1β刺激显著升高HSC-T6和LX-2细胞内HSCs 活化标志蛋白 α-SMA、Collagen-Ⅰ 和 Collagen-Ⅲll的表达(P<0.01 或P<0.05);Helenalin干预能够显著抑制这些标志蛋白的表达(P<0.01或P<0.05),提示,Helenalin能够抑制活化HSCs胶原的合成。与此同时,我们还发现,IL-1β刺激显著升高HSC-T6细胞MMP-9蛋白的表达,并降低TIMP-1蛋白的表达(P<0.01或P<0.05)。Helenalin高剂量显著抑制MMP-9蛋白的表达,上调TIMP-1蛋白的表达(P<0.01)。实验结果提示我们,Helenalin可能通过调控MMPs/TIMPs的平衡,减少胶原沉积。(5)Helenalin能够抑制NF-κB信号通路Western blot结果显示,IL-1β刺激显著上调TLR4、MyD88、p-P65和p-IKKαα蛋白的表达,并下调IκBα蛋白的表达(P<0.01或P<0.05)。Helenalin或PDTC(NF-κB通路抑制剂)干预后,显著抑制活化HSC-T6细胞TLR4、MyD88、p-P65和p-IKKα蛋白的表达,并促进IκBα蛋白的表达(P<0.01),这表明,Helenalin抑制HSCs活化的作用可能与抑制NF-κB信号通路有关。(6)Helenalin能够抑制PI3K/Akt信号通路实验发现,IL-1β刺激显著上调HSC-T6和LX-2细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K蛋白的表达,并下调PTEN蛋白的表达(P<0.01或P<0.05);Helenalin或LY294002(PI3K/Akt通路抑制剂)干预后,显著下调活化细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K蛋白的表达,同时上调PTEN蛋白的表达(P<0.01或P<0.05)。类似的,RT-PCR结果也发现,IL-1β刺激显著上调 HSC-T6 和 LX-2 细胞 PI3K、Akt、mTOR 和 P70S6K mRNA的表达(P<0.01或P<0.05);使用Helenalin或LY294002干预后,显著下调活化 HSC-T6 细胞 PI3K、Akt、mTOR 和 P70S6K mRNA 的表达(P<0.01或P<0.05)。以上实验结果提示,Helenalin可能通过阻断PI3K/Akt通路的信号传导,进而抑制HSCs增殖活化。-(7)Helenalin 能够抑制 miR-200a 表达实验发现,IL-1β刺激后,HSC-T6细胞内miR-200a表达显著降低(P<0.01),而Helenalin干预后,显著上调细胞内miR-200a表达(P<0.01)。转染成功后,RT-PCR结果显示,miR-200a mimics(100 μM)转染效率最高,可用于后续实验。此外,Western blot实验结果显示,过表达miR-200a能够抑制HSC-T6细胞内TLR4蛋白的表达(P<0.01),Helenalin干预能够进一步地抑制miR-200a过表达的HSC-T6细胞内TLR4蛋白的表达(P<0.01)。以上实验结果提示我们,Helenalin对HSCs的抑制作用可能与上调miR-200a,并阻断受其介导的NF-κB和PI3K/Akt信号通路有关。结论:Helenalin能够显著抑制HSCs增殖活化、迁移和集落形成,诱导HSCs凋亡,缓解炎症反应,调控MMPs/TIMPs平衡,减少活化HSCs内胶原的合成,其机制可能与上调miR-200a、继而抑制其介导的NF-κB和PI3K/Akt信号通路有关。