研究背景骨缺损(bone defect)是指由于广泛创伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等原因,造成骨骼丧失骨质,连续性中断,形成较大的间隙及空腔。骨缺损特别是大段骨缺损在临床上较为常见,其治疗策略的选择非常棘手,已成为临床各科医师面临的巨大挑战。骨组织自身的生物学特性决定了其自我修复和再生过程非常困难。传统上对于骨缺损的修复治疗通常采用自体骨移植、同种异体骨移植或植入人工替代材料的方法,然而这样易造成取材部位出现疼痛、功能障碍等并发症或由于排异反应而引发感染、传播疾病等风险。近30年来,随着细胞生物学、分子生物学、组织工程学及生物材料工程学的迅速发展,应用骨组织工程学与再生医学技术相结合的方法治疗骨缺损取得了长足进步,显示出骨组织工程学在临床上具有良好的发展前景。骨组织工程学的研究主要包括对种子细胞选择、支架材料合成、细胞因子作用和组织工程骨构建的研究。理想的骨组织工程种子细胞应该符合以下条件：1、来源广泛,可大量获取；2、收集过程创伤小；3、可按需求定向分化为多种组织,分化过程可控；4、可安全有效的植入自体或同种异体宿主,不出现排斥反应。干细胞是一类未充分分化、尚不成熟、具有自我更新能力(self-renewing)和多向分化能力的多潜能细胞,在一定诱导条件下,干细胞可以按需求分化成多种功能细胞,具有再生各类活体组织、器官的潜在功能,可运用于组织与器官的再生与修复重建,解决临床所面临的心肌梗死、大块骨缺损、脊髓损伤等各类棘手问题。目前干细胞已成为组织工程种子细胞的理想选择,应用前景无限光明,其中研究最为广泛及深入的是间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。MSCs是来源于中胚层的一类多能干细胞,属于成体干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中,骨髓组织中含量丰富。但经过大量研究后发现,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作为组织工程的种子细胞具有一定的局限性,包括：1、骨髓来源有限,且骨髓组织中间充质干细胞含量过少,每10万个细胞中才仅仅含有1个间充质干细胞,远远达不到受损组织再生修复所需用的细胞数量要求；2、取材过程创伤较大,容易造成取材部位的不适。临床上,人们发现皮下脂肪组织可在某些病理情况下形成异位骨,表明脂肪组织中可能存在一类可分化为其他组织细胞的未知细胞。受这一现象启发,各国学者对脂肪组织进行了大量研究,试图找出脂肪组织内可以分化为成骨细胞的那类特殊细胞。2001年,Zuk等人报道从人脂肪抽吸物中分离到一类具有多向分化潜能的新型干细胞,其不具有与BMSCs相同的干细胞表面分子标志物,也具有向骨、软骨、脂肪、肌肉和神经等细胞多向分化的潜在能力,明确地提出脂肪组织中存在一类具有间充质干细胞特性的新型细胞—脂肪源性干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs),以往被作为废物丢弃的脂肪抽吸物有了用武之地。自此以后,ADSCs作为一类种子细胞,广泛应用于各种组织工程动物实验以及一系列疾病的临床试验中。ADSCs来源广泛,能反复提取,获得的干细胞数量大,显著多于骨髓间充质干细胞,并且可不经体外扩增直接应用于各类实验,避免了体外长时间培养扩增所带来的不利影响,更加稳定和安全可靠。因此,ADSCs被认为是骨组织工程的理想种子细胞。而设法监测ADSCs移植后在活体内的迁移路线以及在受体内的定植、生长情况,有助于了解移植细胞最终转归情况,对于评价干细胞移植有效性及可行性具有重要指导意义。近年来,随着生物科学研究及分子影像学的进一步发展,磁共振成像示踪技术具有空间和时间分辨率高、对比度好、有效成像时间长、无创性等优点,可动态观察标记细胞的迁徙过程,同时获得分子、生理及解剖等信息,成为评价干细胞移植效果以及优化治疗方案的理想选择,由此产生了磁共振分子影像学这门学科。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)是一种通过美国FDA认证的新型T2磁共振造影剂,已有商业化产品用于临床。由于具有超顺磁性,SPIO在外加磁场的作用下可产生更强的局域磁场,强烈影响氧化铁纳米颗粒周围水分子中氢质子的弛豫过程,明显缩短T2时间,使所获得的T2加权影像变暗,表现出负增强效果。多项研究表明,超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记间充质干细胞后,不会改变其形态特征,也不会抑制其增殖。目前,采用SPIO标记的磁共振活体示踪干细胞(包括骨髓间充质干细胞与脂肪源性间充质干细胞)已应用于心肌梗死、脑缺血、脊髓损伤、周围神经损伤和股骨头缺血性坏死等多种疾病模型中。SPIO作为外源性金属异物,进入机体后不可避免会受到免疫细胞的识别、吞噬和降解,已有研究发现,SPIO可明显提高Jurkat T细胞的增殖能力和活力。同样,当SPIO标记ADSCs后,对其增殖和活力是否造成影响?加入成骨分化诱导剂共同培养后,是否对ADSCs成骨分化进程造成影响?机制何在?本实验拟通过分离SD大鼠脂肪组织获取ADSCs后,加入SPIO进行体外共培养,最后加入成骨分化诱导剂进行定向成骨分化,初步探讨SPIO对ADSCs成骨分化的影响及在基因水平上可能存在的调控机制。目的1、探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记ADSCs后,对其增殖和活力造成的影响。2、SPIO标记ADSCs后,加入成骨分化诱导剂诱导ADSCs定向成骨分化,研究SPIO对ADSCs定向成骨分化所造成的影响。3、研究SPIO对ADSCs表达成骨相关基因造成的影响。方法1、分离SD大鼠ADSCs,进行体外培养及传代,倒置显微镜下动态观察原代和传代培养的ADSCs的生长形态、结构变化及比较各代之间的差异。2、分别以CD34、CD44、CD45、CD90抗体标记ADSCs,使用流式细胞仪检测分析其细胞免疫表型。3、将经SPIO标记的ADSCs设为实验组,无SPIO标记的ADSCs设为对照组,分别接种于24孔培养板中,接种密度为5×104个细胞/孔；使用手持式细胞计数仪在培养第1、2、3、4、5、6、7天分别对两组细胞进行计数,并描绘生长曲线图。4、诱导ADSCs成骨分化：将实验组和对照组ADSCs接种于6孔板中,接种密度为3×104个细胞/孔；加入足够的常规完全培养液,放在37℃,5%CO2的培养箱中培养24h;当细胞融合至50%-70%时,小心吸去旧的培养液,每孔加入2ml的成骨分化诱导液培养基(含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μmol/L抗坏血酸),每隔2-3天更换新鲜的成骨分化培养基,诱导分化2-4周。5、ALP活性测定：取成骨诱导培养7、14、21及28 d的两组细胞,吸去培养液后PBS液清洗2次,加入1 m1 PBS液,收集细胞,使用超声波细胞破碎仪裂解细胞,进行冻结→融化→冻结→融化操作,再以离心半径10 cm、3000r/min离心10min；吸取上清液移到新的试管作为样品。向培养板内添加100μl底物缓冲液和20μl样品,震荡器上充分振荡1分钟后,37℃下孵育15分钟。添加80μl反应终止液,震荡器上充分振荡1分钟,用酶标仪测量波长520nm处的吸光值OD值,并按试剂盒所提供的公式计算各组ALP活性(金式单位/100m)。每组3个样本。6、茜素红染色法检测细胞外基质矿化率：取成骨诱导分化培养7、14、21及28 d的两组细胞爬片,吸去培养基,并用1×PBS洗3次,每次5min;加入2ml的4%中性甲醛固定4℃30分钟；30分钟后,吸去固定液,并用1×PBS漂洗3次,每次5 min；每孔加入1ml的0.1%茜素红染液,37℃作用30 min；去除染色液,并用漂洗3次,每次5 min；自然干燥,中性树胶封片；置于倒置相差显微镜下观察细胞外基质钙盐沉积情况、拍照。7、成骨细胞诱导形成率计算：成骨诱导分化培养7、14、21及28 d,使用甲醛固定细胞并用茜红素进行钙结节染色。在倒置显微镜下,两组随机取4个100倍视野,用数码相机记录。在计算机上将数码照片放大至14cm×11cm,打印于70g复印纸上,仔细剪取孔底部分,准确称其重量(S),再剪下茜红素染色阳性结节部分,准确称其重量(SI),即成骨细胞诱导形成率(%)=SI/S×100%。8、流式细胞仪检测细胞凋亡率：两组细胞分别用1×Binding Buffer制成1×106细胞/ml的悬液,在5ml的培养管中加入100μl细胞悬液(约1×105个细胞)；加入5～15μg纯化的重组Annexin Ⅴ;轻轻混匀,室温反应15分钟后每管加入5μlAnnexin Ⅴ-FITC和10μl PI;轻柔漩涡混匀,室温避光处放置孵育15分钟；各试验管中再分别加入1 xBinding Buffer 400μl混匀后,室温避光5分钟。1小时内上流式细胞仪测定结果。9、荧光定量RT-PCR检测Runx2、Ocn、ALP和Opn基因转录水平：(1)总RNA的提取(Trizol抽提法)①取对照组和实验组细胞接种于6孔板中,接种细胞量为1×105个细胞数;进行成骨诱导分化实验后,分别按设计的时间点收集细胞：day0、day7、day14;②弃去培养基,用1×PBS清洗一次,每孔中加入1mlTrizol试剂,水平放置片刻,使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞,用移液枪吸头吹打细胞数次使细胞充分溶解,吸取匀浆转移至1.5ml离心管中;③加入200μl氯仿,盖上管盖,用力摇晃15s,在30℃下孵育2-3min,在2～8℃下以不超过12000×g的离心力高速冷冻离心15分钟,使RNA分离；④取一个不含RNA酶的1.5ml离心管,加入500μl异丙醇,将步骤3中的离心后上清液转移到有异丙醇的1.5ml离心管中。用力摇晃混合均匀后,在30℃条件下孵育10分钟,然后在2～8℃下以不超过12000×g的离心力高速冷冻离心15分钟；可见RNA形成一胶片状沉淀附着于试管壁和管底；⑤移去上清悬液,加入1ml 75%乙醇,翻转离心管4-6次,旋涡振荡混合样品并在2～8℃下以不超过7500×g的离心力高速冷冻离心5 mmin,洗脱RNA;⑥移去上清悬液,盖上管盖,低速离心数秒使管壁上的乙醇沉淀聚集到管底。用200μl吸头吸尽残留的乙醇,保留管底的白色RNA沉淀；室温静置5-10min空气干燥RNA；⑦用移液管尖分几次移取加入50～100μl无RNA酶的水溶解RNA,必要时可用移液枪轻轻吹打RNA沉淀,待其完全溶解后储存于-70℃备用；⑧取5μlRNA上机RT-PCR实验：转录水平用GAPDH mRNA水平作为正常对照,所有的退火温度均设为60℃。(2)RNA逆转录合成第一链cDNA① gDNA去除反应：将模板RNA置于冰上解冻,按FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书配制gDNA去除反应体系混合液；彻底混匀后离心,并置于42℃水中孵育3min,然后置于冰上放置。②RNA反转录：按FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书配置反转录反应体系混合液；将反转录反应体系加到gDNA去除步骤的反应液中充分混匀,42℃孵育15min。再于95℃孵育3min后放置于冰上,得到的cDNA保存于-20℃用于后续实验。③将cDNA置于冰上,按2xSYBR Green PCR Mix说明书配置荧光定量PCR反应体系混合液；在荧光定量PCR反应体系混合液中加入2μl第一链cDNA模板,加入适量的ddH20,使总体积达50μl。轻轻充分混匀,离心。然后设定PCR程序,放置于荧光PCR仪中进行荧光定量PCR检测,在适当的温度参数下扩增35个循环。本实验设定如下：Stage 1:预变性(Reps:1)95℃ 1min;Stage 2:PCR反应(Reps:35循环)95℃ 15s,60℃ 35s,72℃ 30s；Stage 3:延伸72℃7min。10、统计学方法：计量数据以均数±标准差(x±s)表示,样本均数间的两两比较采用t检验,各组间比较采用单因素方差分析,应用SPSS17.0软件进行统计学处理分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1、经胶原酶消化法所收获的原代SD大鼠ADSCs培养48h后细胞完全贴壁,细胞变为长梭形,较为扁平,呈成纤维样细胞生长；原代细胞培养48小时候开始增殖,3～5d可达到增殖高峰,呈集落样生长,在6～8d后达到80%左右融合。从第2代开始,细胞贴壁时间和增殖时间较原代明显加快；传代后细胞呈长梭纤维样外观,形态、排列、大小趋于一致,漩涡样生长,增殖能力良好。2、流式细胞仪检测显示,绝大部分SD大鼠ADSCs具有CD44+/CD90+/ CD34-/CD44-的表型,表明ADSCs具有间充质干细胞免疫表型,但与造血干细胞系和血管生成干细胞系干细胞有区别。3、实验组与对照组day1、day2、day3、day4、day5、day6、day7生长曲线均呈S型,第1-2天细胞增殖处于潜伏期,从第3天起细胞开始进入对数生长期。统计学分析表明：day2的细胞数量在实验组和对照组的差异无统计学意义；而day3、day4、day5、day6、day7的细胞数量在实验组和对照组的差异有统计学意义,实验组的细胞数量明显多于对照组。说明标记SPIO后,ADSCs增殖能力不仅没有受到抑制,反而有明显增强。4、ALP在第7天时已具备明显活力,到第21天时到达高峰,随后维持高水平至第28天。自第7天起各个检测点(诱导7、14、21、28 d),实验组与对照组ALP活性差异具有统计学意义(P<0.05),提示标记SPIO后,ALP活性增加。5、成骨诱导分化7d时,实验组ADSCs细胞外开始出现细小矿化结节,并且随着诱导时间延长,矿化结节增多、增大。诱导14d时,实验组与对照组均形成明显矿化结节,28 d达高峰,细胞外有大量钙结节出现,但标记有SPIO的实验组ADSCs矿化结节明显增多、增大,结节中心有大量钙盐沉积。6、自第7天起,标记SPIO后,ADSCs成骨细胞诱导形成率在实验组和对照组的差异有统计学意义,实验组明显高于对照组,说明SPIO能促进ADSCs的成骨分化进程。7、流式细胞仪分析显示,不论有无标记SPIO,ADSCs的凋亡率均低于1%,合适浓度的SPIO对ADSCs基本无害,不会引起细胞大量凋亡。8、不论有无SPIO标记,成骨分化诱导剂作用ADSCs7d后,即可见成骨相关基因Runx-2、Ocn、ALP和Opn基因表达,表达水平稳定、持续,但标记有SPIO的ADSCs成骨相关基因表达水平显著上调,明显高于未标记SPIO的对照组,具有统计学意义(P<0.05)。结论1、经胶原酶消化法所收获的SD大鼠原代ADSCs具有间充质干细胞免疫表型,增殖能力良好,传代细胞生物学特性稳定。2、标记SPIO后,能促进ADSCs增殖,不影响其细胞凋亡率,同时提高了ALP活性,增加了细胞外基质矿化结节形成率及成骨细胞诱导形成率。3、不论有无标记SPIO,使用间充质干细胞成骨分化诱导培养液,能将第三代的ADSCs诱导为成骨细胞。4、SPIO能通过增强成骨相关基因Runx-2、Ocn、ALP和Opn的表达,促进ADSCs的成骨分化。5、本研究的不足之处：①应该进一步行普鲁士兰染色及透视电镜检测,以证实SPIO颗粒位于ADSCs细胞胞浆内及了解SPIO在细胞内分布情况,显示共培养的可靠性。②需要进一步了解经SPIO标记的ADSCs成骨分化后,使用免疫组化及蛋白免疫印迹方法检测细胞内Runx-2、Ocn、ALP和Opn蛋白表达情况。③需要进一步探讨SPIO标记ADSCs后,在信号通路方面对细胞增殖、分化和衰老所产生的变化进行深入研究。④还需设计、制造骨缺损模型后,进一步行动物体内模型实验进行验证。