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目的:热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)在多种肿瘤中高表达,在宫颈癌中HSP70基因也是高表达的,表明该基因在癌变过程中起着重要的作用。研究表明,肿瘤细胞的不断增殖,需要大量的HSPs作为“分子伴侣”来调节和稳定这一异常增殖的过程,HSPs参与细胞周期调节、DNA损伤的修复,被认为与细胞周期,肿瘤的发生发展,肿瘤免疫以及机体对肿瘤治疗耐受性的发生及肿瘤预后等密切相关。为进一步了解HSP70基因在宫颈癌发生发展过程中的作用,本文采用RNAi方法,制备针对HSP70基因的特异性siRNA序列,瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察HSP70基因对宫颈癌HeLa细胞的增殖和凋亡的影响,阐明HSP70基因在宫颈癌HeLa细胞中的作用,为治疗宫颈癌提供新的基因治疗靶点。方法:1.针对HSP70基因设计siRNA序列,克隆到空载体pTZU6+1中,转化DH5α菌株,扩增提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。2.在LipofectamineTM2000的介导下瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,转染时细胞分为三组:第一组为实验组,转染重组体pHSP70-siRNA,第二组为阴性对照组,转染空载体pTZU6+1,第三组为空白对照组,即不加转染试剂也不加任何质粒。分别在转染48h后,提取各组HeLa细胞总RNA和蛋白,采用RT-PCR、Western blot方法检测转染前后HeLa细胞中HSP70基因的表达情况,以鉴定该重组体的表达。3.在转染24h、48h、72h,采用MTT方法检测细胞生长与增殖的变化。在转染48h收集各组细胞,采用AO/EB双染色法检测各组细胞形态的变化,通过流式细胞术方法检测重组体pHSP70-siRNA对宫颈癌HeLa细胞的凋亡率及细胞周期分布的影响。结果:1.pHSP70-siRNA经酶切鉴定和测序分析,结果显示重组体构建成功,并将其命名为pHSP70-siRNA。2.将重组体pHSP70-siRNA瞬时转染宫颈癌HeLa细胞后,采用RT-PCR、1%琼脂糖凝胶电泳可获得HSP70和内参GAPDH的2个条带,实验组中HSP70/GAPDH灰度比值为(0.35±0.03),而阴性对照组和空白对照组中HSP70/GAPDH的灰度比值分别为(0.76±0.05)、(0.66±0.07)。经统计学分析表明,实验组中HeLa细胞mRNA的表达相对量与阴性对照组相比有统计学意义(P<0.01),而空白对照组和阴性对照组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。结果表明:重组体pHSP70-siRNA瞬时转染宫颈癌HeLa细胞能特异性降低HSP70 mRNA在HeLa细胞中的表达。Western blot方法检测实验组、阴性对照组、空白对照组的HSP70/β-actin灰度比值分别为(2.46±0.39)、(4.68±0.32)、(4.57±0.22)。统计学分析表明:实验组HeLa细胞的蛋白表达量与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),而空白对照组和阴性对照组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。Western blot实验结果表明转染重组体pHSP70-siRNA后的宫颈癌HeLa细胞中HSP70蛋白表达明显下调。3.重组体pHSP70-siRNA瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,分别在24、48、72h,采用MTT法检测各组细胞的吸光值,根据公式计算:抑制率(%)=[1-处理组OD(570)值/空白组OD(570)值]×100%,在24h,实验组、阴性对照组、空白对照组的抑制率分别为10.35±0.42、4.11±0.16、3.58±0.31,在48h的抑制率分别为17.99±0.44、4.00±0.19、3.56±0.23,在72h的抑制率分别为15.97±0.61、3.97±0.16、3.63±0.33,结果显示实验组的细胞抑制率明显高于阴性对照组(P<0.01),有统计学意义,且实验组在48h时细胞抑制率达到最高,而空白对照组和阴性对照组之间差异没有统计学意义(P>0.05)。MTT实验结果表明重组体pHSP70-siRNA对宫颈癌HeLa细胞的生长与增殖有明显的抑制作用。AO/EB染色法结果表明转染重组体pHSP70-siRNA的宫颈癌HeLa细胞出现明显的细胞凋亡形态,而阴性对照组和空白对照组的细胞形态变化不明显。流式细胞术检测各组细胞的周期分布,实验组细胞GO/G1、S、G2/M期分别占(51.76±0.80)%、(42.16±0.64)%、(6.09±0.16)%,阴性对照组细胞GO/G1、S、G2/M期分别占(61.18±0.29)%、(36.76±0.21)%、(2.06±0.09)%,空白对照组细胞GO/G1、S、G2/M期分别占(60.70±0.35)%、(37.44±0.65)%、(1.85±0.30)%,结果表明转染重组体pHSP70-siRNA后,G2/M和S期细胞有所增加,GO/G1期细胞减少,说明重组体pHSP70-siRNA可能通过阻滞细胞有丝分裂,使细胞堆积在S期和G2/M期,从而阻止HeLa细胞周期的进展,抑制HeLa细胞的增殖。流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,得到实验组、阴性对照组、空白对照组的凋亡率分别为37.07±0.75%、3.06±0.09%、3.04±0.07%,且从流式细胞图上可见实验组细胞有明显的凋亡二倍体峰。结论:1.酶切鉴定和测序分析重组体证明pHSP70-siRNA构建成功。2.瞬时转染重组体pHSP70-siRNA入宫颈癌HeLa细胞,①HSP70基因的表达能有效抑制。②宫颈癌HeLa细胞的生长与增殖受到抑制。③重组体pHSP70-siRNA使HeLa细胞堆积在S期和G2/M期,阻止细胞周期的进展,并出现凋亡二倍体峰,提示重组体pHSP70-siRNA抑制宫颈癌HeLa细胞的生长与增殖可能通过阻滞HeLa细胞有丝分裂来实现的。3.综上所述,HSP70基因作为“分子伴侣”起着调节和稳定肿瘤细胞异常增殖的过程,它在肿瘤的发生、发展、肿瘤免疫以及机体对肿瘤治疗耐受性的发生及肿瘤预后都有关。