【摘 要】
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TNFSF15/TL1A是肿瘤坏死因子超家族的重要成员,参与机体炎症反应和免疫防御。硬骨鱼中有关TNFSF15/TL1A的研究极为有限,其功能尚不明确。2007年,Wines等人克隆了斑马鱼TNFSF15/TL1A基因并进行了序列分析,最近,Lim等人（2021年）在石鲷中克隆了TNFSF15/TL1A基因,但这些研究未对TNFSF15/TL1A的表达调控和功能展开深入研究。本研究在获得CiTNF
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TNFSF15/TL1A是肿瘤坏死因子超家族的重要成员,参与机体炎症反应和免疫防御。硬骨鱼中有关TNFSF15/TL1A的研究极为有限,其功能尚不明确。2007年,Wines等人克隆了斑马鱼TNFSF15/TL1A基因并进行了序列分析,最近,Lim等人（2021年）在石鲷中克隆了TNFSF15/TL1A基因,但这些研究未对TNFSF15/TL1A的表达调控和功能展开深入研究。本研究在获得CiTNFSF15/TL1A基因全长的基础上,对CiTNFSF15/TL1A的生物学功能进行初步探究,旨在全面阐明CiTNFSF15/TL1A的免疫功能,为后续研究奠定基础。本研究对CiTNFSF15/TL1A基因在病原相关分子模式刺激后的表达情况进行了分析。分别用LPS和poly（I:C）对实验草鱼进行腹腔注射,在刺激后不同时间点解剖草鱼,取其脾脏与头肾组织提取总RNA,将其逆转录成c DNA模板,利用实时定量PCR（RT-q PCR）对CiTNFSF15/TL1A基因表达进行定量分析。结果显示,在腹腔注射20μg/m L LPS 48 h时,CiTNFSF15/TL1A基因的表达水平出现了显著上调（p＜0.05）。腹腔注射poly（I:C）后,在24 h时CiTNFSF15/TL1A基因的表达水平出现显著下调现象（p＜0.05）,在48 h时恢复正常,在72 h时显著上调（p＜0.05）。这些结果表明,LPS和poly（I:C）均可调控CiTNFSF15/TL1A基因的表达,暗示该基因在抵御病原侵染中发挥功能。本研究在大肠杆菌中表达并纯化了草鱼CiTNFSF15/TL1A的重组蛋白,并验证了其蛋白活性。分离草鱼头肾原代细胞,将其与不同浓度的CiTNFSF15/TL1A重组蛋白共孵育24 h,收集细胞并检测免疫基因的表达,检测的免疫基因包括:TNFSF15/TL1A、TNFRSF25/DR3,interleukin（IL-1β）、interferon（IFN）-γ、tumor necrosis factor（TNF-α）、IFN-1、IL-10、IL-22、IL-2、Caspase-7、Caspase-8、和METRL。结果表明,CiTNFSF15/TL1A刺激草鱼原代肾脏细胞24 h后,CiTNFSF15/TL1A基因的表达量没有显著变化,但是,TNFRSF25/DR3基因在细胞受到50 ng/μL浓度的CiTNFSF15/TL1A重组蛋白刺激后,表达量出现了显著升高（p＜0.05）,50 ng/μL浓度的CiTNFSF15/TL1A重组蛋白能显著提高IL-1β、IFN-γ、Caspase-8基因的表达（p＜0.05）,其中IL-1β与Caspase-8的表达量为极显著的升高（p＜0.01）。上述结果证明,CiTNFSF15/TL1A重组蛋白具有生物活性,且可以调控炎症相关因子以及凋亡有关细胞因子的表达。用pcDNA3.1-CiTNFSF15/TL1A重组质粒转染草鱼肾脏（CIK）细胞36 h使其过表达,Annexin V-FITC和PI染料对细胞进行染色后通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况,发现CIK细胞出现凋亡情况。将pcDNA3.1-CiTNFSF25重组表达质粒转染入人HEK293T细胞,用CiTNFSF15/TL1A重组蛋白孵育细胞36 h,Annexin V-FITC和PI染料对细胞进行染色后,通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况,发现细胞凋亡情况与CIK细胞实验类似。上述体外实验表明,CiTNFSF15/TL1A重组蛋白具有促使细胞凋亡的功能。
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