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创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）以其高死亡率及严重的后遗效应受到社会的广泛关注。认知功能障碍是TBI慢性期严重影响患者生活质量的并发症,空间记忆障碍是认知功能损伤后的重要表现。TBI患者脑内可检出过度磷酸化tau蛋白及其聚合或缠结产物,这些产物统称为tau蛋白病变,它是以认知障碍为主要特征的阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）的典型病理改变之一。因此,包括慢性创伤性脑病在内的TBI后情感、认知功能障碍类疾病及其他含有tau蛋白病变的神经退行性疾病被统称为tau蛋白病。近年对AD的研究发现tau蛋白病变可在脑内复制及传播,可能是病情进展的重要机制。而TBI所致空间记忆障碍患者脑内tau蛋白病变的出现早于AD等其他神经退行性疾病,脑区分布规律也具有自己的特点。这些是否是导致TBI后认知障碍早期出现的原因目前仍不明确。TBI后大量产生的腺苷可以激活腺苷A2A受体(Adenosine A2A Receptor,A2AR),研究结果表明拮抗A2AR可以降低AD患者脑内tau蛋白磷酸化水平、减少淀粉样斑块的堆积,并显著改善认知功能、情感障碍等神经功能异常。另外,近年研究发现的“类淋巴”系统在星形胶质细胞水流的介导下参与清除细胞外代谢废物。水通道蛋白4（AQP4）在血管周围星形胶质细胞终足的极性分布是类淋巴系统中介导物质清除的星形胶质细胞水流定向流动的关键,受星形胶质细胞活化及磷酸化修饰调控。而A2AR的激活与星形胶质细胞的活化及cAMP/PKA等信号通路关系密切。因此我们希望通过本课题的研究探索A2AR促进TBI后多个脑区p-tau产生增多及清除障碍的机制及与空间记忆功能障碍的关系。本研究中,我们使用可控皮质打击方法（controlled cortical impact,CCI）建立中度TBI模型。应用免疫组织化学、western blot等方法检测TBI后24 h、7 d及4 w小鼠脑内tau蛋白磷酸化水平升高的时间、空间及细胞分布规律。进而在A2AR基因敲除小鼠及药理学干预等条件下在动物整体水平检测TBI后A2AR活化引起的神经元内tau蛋白磷酸化水平升高及相关轴突、树突损伤情况;通过行为学实验检测空间记忆（空间参考记忆及空间工作记忆）功能障碍;免疫荧光方法观察星形胶质细胞内A2AR表达升高与特定脑区的类淋巴系统关键分子AQP4的极性分布受损及胞外tau蛋白清除障碍的关系;最后,通过过表达人P301S位点突变tau蛋白及脑区特异性激活A2AR,探讨A2AR对p-tau由海马向前额叶皮质传播的促进作用,并通过western blot及免疫共沉淀手段分析其分子机制。主要实验结果及结论:1.在中度创伤性脑损伤后24 h、7 d及4 w时间点检测tau蛋白在Thr205、Ser262、Ser404等位点的磷酸化水平。通过与神经元标志物Neun共染,确定磷酸化tau蛋白的细胞定位。结果表明,TBI后tau蛋白磷酸化水平升高,主要位点为Ser404。伤后24 h在伤侧皮层、海马、丘脑及对侧皮层、海马、丘脑即出现tau蛋白Ser404位点磷酸化水平升高。伤后7 d,磷酸化tau蛋白水平在伤侧皮层、丘脑及对侧皮层、海马仍继续升高。此外,前额叶皮质也开始出现磷酸化tau蛋白的堆积。伤后4 w,磷酸化tau蛋白主要位于伤侧丘脑及对侧海马、前额叶皮质。过度磷酸化tau蛋白主要位于神经元内。淀粉样肽前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）及高尔基染色的结果表明,TBI后tau蛋白磷酸化水平升高与神经元轴突、树突损伤关系密切。行为学结果显示TBI后空间记忆功能受损,其中空间参考记忆伤后7d损伤显著,伤后4w恢复至与sham组无显著差异;空间工作记忆功能伤后7d及4w均低于sham组。以上结果提示TBI后tau蛋白Ser404位点磷酸化水平立即升高并持续至伤后4w,p-tau升高的脑区包括伤侧及对侧顶叶皮质、海马、前额叶皮质、丘脑等空间记忆环路中的多个关键脑区,p-tau堆积区存在神经元损伤树突与轴突损伤,空间记忆功能障碍的出现时间与p-tau升高及神经元损伤相符。以上现象可能是导致TBI后慢性期空间记忆功能障碍迅速出现的重要原因。2.在动物整体及细胞水平,通过药理学(A2AR特异性拮抗剂ZM241385、非特异性拮抗剂咖啡因)及基因敲除手段探讨A2AR调控TBI后tau蛋白磷酸化水平的分子机制以及抑制A2AR对空间记忆的保护作用。结果表明A2AR调控神经元内p-tau水平的机制包括:（1）通过激活PKA进而易化GSK-3β对tau蛋白Ser404位点的磷酸化作用;（2）敲除A2AR可以直接导致GSK-3β抑制性磷酸化位点Ser9磷酸化水平的升高,降低tau蛋白磷酸化水平。高尔基染色结果表明TBI后4 w对侧海马齿状回树突棘密度减少,与学习记忆功能关系密切的细长形及蘑菇形树突棘密度降低,失能的短粗形树突棘比例升高,抑制A2AR可以显著改善以上神经元树突损伤。A2AR基因敲除可以改善TBI后小鼠空间参考记忆及空间工作记忆损伤。慢性口服咖啡因可以得到更好的保护空间工作记忆的效果。因此,以上结果表明TBI可通过促进神经环路相关脑区A2AR的活化导致tau蛋白磷酸化水平升高,这也可能为tau蛋白病变传播提供了必需的“种子”。3.研究表明类淋巴系统对细胞外液溶质的清除需要依赖AQP4在血管周围的极性分布介导的脑脊液及间隙液“集流”,AQP4的极性分布与反应性星形胶质细胞增生关系密切。我们通过检测A2AR的表达水平、及GFAP与AQP4共染,发现TBI后对侧海马A2AR表达持续升高至伤后4 w,其中3 d达到高峰。伤后7 d,升高的A2AR位于神经元及星形胶质细胞中。伤后4 w,神经元内A2AR水平降低,星形胶质细胞中A2AR表达水平仍较高。TBI引起对侧海马CA1区星形胶质细胞增生显著,AQP4失去血管周围的极性分布而移动到胞体及粗大的星形胶质细胞突起内。磷酸化tau蛋白水平也随之升高。并伴随出现对侧海马CA1区放射层及多形层树突棘密度减少,短粗形树突棘比例增高,蘑菇形及瘦长形树突棘比例降低。敲除A2AR可以显著改善TBI后慢性期反应性星形胶质细胞增生、AQP4极性紊乱、磷酸化tau蛋白堆积及树突棘形态异常等神经病理改变。以上结果表明TBI后星形胶质细胞内A2AR水平升高与特定脑区AQP4极性紊乱、细胞外p-tau清除障及神经元损伤有关。4.通过在非脑损伤小鼠海马过表达人P301S突变tau蛋白,或在轻度TBI模型中伤后7 d开始连续7天在损伤对侧海马齿状回注射A2AR激动剂CGS21680,检测海马及前额叶皮质内tau蛋白磷酸化水平改变。结果显示海马过表达P301Stau蛋白可引起注射区周围神经元及同侧、对侧前额叶皮质等海马神经纤维投射区神经元胞体内p-tau（Ser404）含量升高。轻度TBI模型中,注射CGS21680激活A2AR可以引起注射位置tau蛋白磷酸化水平显著升高,同时在两侧前额叶皮质内也可以观察到磷酸化水平升高的tau蛋白,并显著高于假手术组及TBI+vehicle组。以上结果表明p-tau沿神经投射跨脑区传播可能是TBI后p-tau出现在未直接受损的PFC区的原因。通过免疫荧光方法检测调控微管解聚的关键分子——驱动蛋白重链2A（kinesin heavy chain member 2A,KIF2A）发现TBI后伤侧半球KIF2A显著升高,伤后7 d对侧海马也检测到KIF2A含量升高。进而通过免疫共沉淀检测转位因子相关蛋白（translin-associated protein X,TRAX）及KIF2A与A2AR的蛋白质相互作用,发现TBI后A2AR对p-tau跨脑区传播的促进作用可能通过TRAX-KIF2A信号实现。综上,我们的研究表明TBI一方面通过激活对侧海马A2AR信号通过PKA/GSK-3β途径促进细胞内tau蛋白磷酸化水平升高,产生了tau蛋白传播的“种子”;另一方面也可能通过TRAX/KIF2A这一非经典途径促进过度磷酸化tau蛋白由对侧海马传播至对侧前额叶皮质,导致TBI后多个脑区p-tau含量升高,进而导致空间记忆功能障碍的早期出现。此外,星形胶质细胞的A2AR可能通过引起AQP4分布极性紊乱,导致星形胶质细胞水流介导的物质清除功能障碍,胞外tau蛋白的堆积,成为磷酸化tau蛋白扩散至临近细胞形成tau蛋白病变局部扩散的危险因素。以上机制的阐明为以A2AR为靶点多环节抑制和减少Tau蛋白磷酸化治疗与预防TBI后快速出现的空间记忆功能障碍提供了重要的实验依据。