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胶原蛋白(collagens)是一类细胞外基质蛋白,在维护各种组织的结构完整性方面,扮演着重要的角色。胶原蛋白具有独特结构,并因此而具而有低抗原性和优良的生物相容性,使其成为一种重要的生物医学材料,而且这种重要性与日俱增,但胶原主要是从动物的组织中提取的,这样会带来很多麻烦,如免疫排斥和病原菌的污染,因此,利用高效的、规模化的重组体系统来生产重组人胶原将得到广泛的应用。 本研究以流产胎儿的胎皮等为试材,用Trizol提取其总RNA,反转录获得cDNA第一条链,设计特异引物,引入EcoRI和NotI双酶切位点,优化PCR条件,扩增出317bp的目的条带,经测序并与GenBank上公布的人Ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列比对,其相似性达99.66%。同时,根据毕赤酵母的密码子使用情况,人工设计并合成了317bp的优化基因,将其和天然的人Ⅲ型胶原蛋白α1链三肽区基因分别与表达载体pET28a-连接,获得重组原核表达载体pET-28a-ColⅢ(N)和pET-28a-ColⅢ(A),将两个重组原核表达载体转入BL21(DE3)菌中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,在13kD处出现蛋白特异条带,与预期蛋白大小相符,初步表明目的基因在原核细胞获得表达。 将人Ⅲ型胶原蛋白的α1链三肽区基因和密码子优化的类人胶原基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建出酵母表达载体pPIC9K-ColⅢ(N)和pPIC9K-ColⅢ(A)。经测序无误后将重组质粒用SacⅠ线性化,分别电击转化毕赤酵母菌GS115,验证整合情况,利用0.5%甲醇浓度诱导其分泌表达,表达产物直接分泌到培养上清中,通过SDS-PAGE电泳分析,与对照相比,在分子量约为13kDa处出现一条特异的蛋白带,且经密码子优化的重组子表达量高于含天然基因的重组子,培养基中目的蛋白表达量为0.1g/L。