论文部分内容阅读
目的：1．观察双链DNA分子poly(dA-dT)·poly(dT-dA)是否能够诱导肝细胞产生Ⅰ型干扰素及其可能的分子通路。2．了解HBV感染是否影响细胞对dsDNA刺激产生的反应，观察poly(dA-dT)·poly(dT-dA)对肝细胞内HBV复制的影响及其信号传导。3．探讨胞内DNA受体DAI(DLM-1／ZBP1)分子在poly(dA-dT)·poly(dT-dA)诱导的Ⅰ型干扰素的产生与HBV复制中的可能作用。方法：1．poly(dA-dT)·poly(dT-dA)转染HepG2与HepG2215细胞，real time RT-PCR检测Ⅰ型干扰素IFN-β、干扰素应答基因IFIT1与炎症因子TNF-α的表达，western blot检测NF-κB、IRF3、TBK1以及磷酸化的TBK1的表达。2．HBV1.3复制型质粒pHY106+wta转染HepG2细胞，HBV siRNA转染HepG2215，real time RT-PCR检测细胞中IFIT1的表达。3．poly(dA-dT)·poly(dT-dA)转染HepG2215细胞，southern blot检测细胞内HBV的复制中间体，real time PCR检测细胞上清中HBV颗粒，CMIA检测HBV s抗原与e抗原的表达。利用抑制剂阻断NF-κB、IRF3以及MAPK激酶信号通路，southern blot观察poly(dA-dT)·poly(dT-dA)对肝细胞内HBV复制中间体的影响。Western blot检测细胞内ERK1／2的磷酸化。4．RT-PCR、western blot检测DAI(DLM-1／ZBP1)分子在肝癌细胞系中的表达。DAI(DLM-1／ZBP1)siRNA转染HepG2与HepG2215细胞，real time RT-PCR检测IFIT1的表达，southern blot检测HepG2215细胞中HBV复制中间体的表达。结果：1．poly(dA-dT)·poly(dT-dA)能够诱导HepG2215细胞产生Ⅰ型干扰素，且具时间与剂量依赖性，HepG2215细胞与HepG2细胞对poly(dA-dT)·poly(dT-dA)的应答明显不同，HepG2细胞对poly(dA-dT)·poly(dT-dA)的应答比HepG2215细胞早，但持续时间短。NF-κB参与了HepG2215细胞中TNF-α的产生，IRF3信号通路参与了poly(dA-dT)·poly(dT-dA)诱导的Ⅰ型干扰素的产生，TBK1在其中发挥了重要作用。2．上调或下调肝细胞内HBV的复制与病毒蛋白表达后，再用poly(dA-dT)·poly(dT-dA)处理，肝细胞表达IFIT1的动力学曲线不受影响，但HBV下调后，HepG2215细胞中IFIT1表达明显升高。3．poly(dA-dT)·poly(dT-dA)能够促进HepG2215中HBV的复制，但对病毒蛋白的表达及病毒粒子分泌没有影响。ERK／MAPK信号通路抑制剂U0126能抑制poly(dA-dT)·poly(dT-dA)增强的HBV复制。poly(dA-dT)·poly(dT-dA)作用HepG2215后，能够减弱ERK1／2的磷酸化。4．在HepG2、HepG2215以及Huh7中存在不同程度的DAI(DLM-1／ZBP1)分子的表达，在维甲酸RA以及TLR2配体Pam3cys、TLR4配体LPS的刺激下，DAI(DLM-1／ZBP1)表达增强。DAI(DLM-1／ZBP1)分子表达下调不影响HepG2与HepG2215细胞中IFIT1的表达，但HepG2215细胞中HBV的复制明显减弱。结论：1．ds-DNA能够刺激肝癌细胞HepG2与HepG2215产生Ⅰ型干扰素应答，同时伴随IRF3与NF-κB的活化。2．ds-DNA能够促进HBV的复制，但不影响病毒蛋白表达与病毒粒子分泌，ERK／MAPK信号通路可能参与了这一事件。3．在人肝癌细胞中存在DAI(DLM-1／ZBP1)分子的表达，DAI(DLM-1／ZBP1)分子不参与ds-DNA诱导的Ⅰ型干扰素的产生，但可能通过直接或间接的方式影响HBV的复制。本研究的创新点及意义：1．了解双链DNA能否诱导肝细胞产生Ⅰ型干扰素应答，探讨相关的信号分子通路，同时观察双链DNA对肝细胞内HBV复制的影响，为双链DNA载体在HBV慢性感染基因治疗上的应用提供参考。2．了解在双链DNA诱导人肝细胞产生Ⅰ型干扰素应答过程中，DAI(DLM-1／ZBP1)是否作为胞浆DNA受体分子发挥作用，同时观察在HBV感染肝细胞中，DAI(DLM-1／ZBP1)分子是否影响HBV复制，为DAI(DLM-1／ZBP1)分子功能研究提供实验依据。