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肾细胞癌(简称肾癌,Renal Cell Carcinoma)是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,在所有泌尿系统恶性肿瘤中,其发病率仅次于膀胱癌,患病率约占成人恶性肿瘤的2～3%。根据全国肿瘤登记年报统计结果显示,肾癌的发病率和死亡率分别为4.5/10万和1.46/10万,男性患者的发病率约是女性患者的2倍,城市人口的发病率是农村人口的4倍。近半数肾癌患者在来院就诊前已出现癌转移现象,局限性肾癌患者进行手术治疗后,约30%的患者出现复发。近年来,随着其发病率的逐年升高,肾癌对人群的危害日益严重。胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(The Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)是近期发现的一种相对分子量为69kDa的肿瘤抑制蛋白。研究表明,在不同组织类型的肿瘤中,Keap1在肿瘤组织中的表达明显异于癌旁正常组织。在肺癌、卵巢癌、肝癌等癌症患者肿瘤组织中,Keap1基因出现不同结构位点的失活或突变；临床分析中发现,在卵巢癌患者肿瘤组织中,Keap1的低表达与高死亡率有关；肺癌组织免疫组化结果分析发现,Keap1的表达量在正常组织和肿瘤组织之间存在显著性差异,提示Keap1能够作为某些肿瘤临床诊断的潜在指标,应用于临床检验研究。Keap1调控肿瘤发生发展的具体作用机制尚不明确,据目前的研究分析,Keap1主要通过三种不同的方式影响肿瘤的发生和进展。1.正常条件下,Keap1与泛素连接酶E3(Cul-3)形成复合体,结合细胞氧化应激的关键转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2),泛素化降解Nrf2,调控Nrf2-ARE信号通路,影响抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达,进而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡能力以及对化疗药物和放射治疗的敏感性；2.Keap1能够抑制IKB激酶p(IKKβ)的表达,IKKβ是一种重要的致癌因子,它能够抑制多种抑癌因子的表达,并且能够激活NF-κB信号通路,调节肿瘤细胞的增殖、免疫应答、肿瘤生长浸润等相关基因的表达；3.Keap1能够与B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白结合,抑制Bcl-2的表达,诱导细胞凋亡。目前,国内尚缺乏有关Keap1与肾癌发生发展关系的研究报道。本研究通过比较Keap1在肾癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达情况,结合体外细胞实验观察Keap1对肾癌细胞的生长、增殖的影响,探讨Keap1在肾癌发生和发展中的作用及机制。目的检测胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)及转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)在肾癌患者临床标本及肾癌细胞系内的表达情况,分析其表达量与临床病理特征之间的联系。运用体外细胞实验观察Keap1对肾癌细胞系ACHN增殖活性和克隆形成能力的影响,探讨Keap1在肾癌的发生和发展中的作用及机制。方法1.收集2014年5月至2015年4月山东大学第二医院泌尿外科收治的32例肾癌患者的组织标本,通过Q-PCR和免疫组织化学技术分别从mRNA和蛋白水平上检测Keap1和Nrf2在肾癌肿瘤组织及癌旁正常组织内的表达情况,并分析两者在不同组织内的表达差异及两者之间的相关性。2.运用Q-PCR和Western Blot技术检测Keap1和Nrf2在人肾永生化皮质近曲小管上皮细胞系HK-2和人肾癌细胞系ACHN中的表达差异。3.构建过表达Keap1的瞬转肾癌细胞系ACHN,检测过表达Keap1后对Nrf2、Bcl-2的表达的影响。4.运用CCK-8法检测和克隆形成法检测过表达Keap1后对肾癌细胞系ACHN增殖活性及克隆形成能力的影响。结果1.临床标本nRNA水平和蛋白水平检测结果表明,Keap1在肾癌组织内的表达低于癌旁正常组织,Nrf2在肾癌组织内的表达高于癌旁正常组织。统计学分析显示,两者在不同组织内的表达均具有统计学意义(P<0.05)。根据临床病理资料分析得,两者的表达强弱与患者病理分型存在相关性,与患者的年龄和性别没有明显的差异(P>0.05)。2.细胞水平Q-PCR与Western Blot结果显示,Keap1与Nrf2在两种细胞系内均有表达,Keap1在肾癌细胞系ACHN中的表达低于人肾永生化皮质近曲小管上皮细胞系HK-2；Nrf2在ACHN中的表达要高于HK-2。3.在ACHN细胞系内转染过表达Keap1质粒后发现,Keap1的过表达能够促进Nrf2的泛素化降解水平,同时也能够抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达水平。4.在过表达Keapl后,肾癌细胞系ACHN的增殖活性和克隆形成能力均明显减弱(P<0.05)。结论Keap1和Nrf2在肾脏肿瘤和相应癌旁正常组织内均有表达, Keap1在癌旁正常组织内的表达更高,而Nrf2在肾肿瘤组织内的表达更加明显,这两者在肿瘤组织内表达呈负相关。本次研究采用了配对的临床样本资料,增强了组间的均衡性,证实了Keap1在肾癌患者的不同组织间的差异性。首次证明了在。肾癌细胞系中,Keap1能够抑制Nrf2和Bcl-2的表达,并能抑制细胞增殖活性和克隆形成能力,为肾脏肿瘤的基因治疗提供一个新的思路,并为临床患者的诊断、治疗以及预后效果的评估提供一个新的靶点。