WRKY蛋白广泛参与调控植物的生长、发育、衰老以及胁迫应答等生物进程,是最重要的植物胁迫应答转录因子家族之一,因此,WRKY转录因子的功能研究及其胁迫应答机制研究意义重大。根据前期的转录组测序结果,选取了来自小黑杨(Populus simonii×Populusnigra)WRKY超家族Group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚家族的20条盐胁迫应答PsnWRKY基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。结果表明,PsnWRKY70基因(Potri.016G137900)既能响应生物胁迫又能响应非生物胁迫。为了进一步探究小黑杨WRKY Group Ⅲ亚家族成员——PsnWRKY70基因/PsnWRKY70转录因子在生物与非生物胁迫应答进程中的功能及其胁迫应答机制,本研究开展了酵母单杂交、酵母双杂交、遗传转化、抗逆性分析以及转录组测序等一系列的分子生物学及生理学实验。首先,利用染色体步移法克隆了Psn WKY70基因的启动子,对其测序并进行序列分析后发现,PsnWRKY70基因的启动子(转录起始位点上游2372bp的序列)区含有大量的胁迫应答相关的顺式作用元件(例如W-box、GT1、MYBST1、MYCCONSENSUSAT、CURECORECR 以及 ERELEE4 元件等),暗示着PsnWRKY70 基因很可能参与调控小黑杨胁迫应答信号转导网络。为了更加深入地挖掘PsnWRKY70基因的上游调控因子及PsnWRKY70转录因子的互作蛋白,构建了盐胁迫条件下的小黑杨叶片pGADT7-DEST cDNA文库并进行了酵母单杂交和酵母双杂交筛库实验。酵母单杂交筛选及烟草瞬时转化验证实验表明,在盐胁迫条件下的植物细胞环境中,PsnWRKY70、PsnNAM、PsnMYB和PsnGT1蛋白能通过结合PsnWRKY70基因启动子区的W-box或GT1元件从而调控该基因的表达。酵母双杂交筛选及GST-Pull Down体外验证结果表明,HP1(预测蛋白1,含有clpP结构域)、RRM(包含RNA识别基序的蛋白)和Ulp1(泛素样修饰蛋白酶1)蛋白能够通过直接与PsnWRKY70转录因子相互作用来应答盐胁迫。利用根癌农杆菌介导的叶盘法对小黑杨进行同源遗传转化,获得PsnWRKY70超表达(OEX)株系8个、干扰表达(REX)株系10个。用NaCl(高盐)、PEG-6000(干旱)以及Altelterian alternata(Fr.)Keissl(叶枯病病原菌)胁迫处理转基因和非转基因(NT)株系后,对各株系进行抗逆性分析。根据表型观测、苗高测定、叶片灾害指数调查、光合作用相关参数测定、丙二醛(MDA)含量测定等结果可知,OEX株系表现出比NT株系更强的抗病性,而REX株系则表现出比NT株系更强的耐盐性和耐旱性;根据PsnWRKY70基因表达量的胁迫应答时序变化模式分析可知,PsnWRKY70转录因子可能在小黑杨叶枯病病原菌胁迫应答进程中扮演正向调控因子的角色,而在高盐和干旱胁迫应答信号转导网络中则有可能担当负向调控因子。对盐胁迫后的NT、OEX1和REX1株系进行转录组测序,结果表明,OEX1与NT株系之间的差异表达基因(DEGs)除了与常见的盐胁迫应答进程相关以外,还与病胁迫应答进程相关(6条病原菌应答DEGs)。根据qRT-PCR验证及启动子序列分析结果可知,这6条病原菌应答DEGs可能是PsnWRKY70转录因子的下游靶基因。此外,OEX1和REX1中的很多DEGs属于MAPK级联信号转导系统(MAPK cascade)成员,结合既有的文献报道,我们推测这些MAPK基因所对应的蛋白质可能通过与小黑杨的一些胁迫应答WRKY转录因子(包括PsnWRKY70)相互作用而应答高盐胁迫。综上所述,本研究围绕PsnWRKY70基因/PsnWRKY70转录因子进行了生物与非生物胁迫条件下的时序应答模式分析、启动子功能研究、基因功能研究以及胁迫应答信号转导通路探究,揭示了Psn WKY70基因在小黑杨高盐胁迫、干旱胁迫以及叶枯病胁迫应答进程中的作用,归纳总结了PsnWRKY70转录因子所参与的胁迫应答信号转导通路。本研究所获得的研究结果与结论能够为庞大而复杂的小黑杨胁迫应答信号转导网络的完善提供有意义的线索,为今后的小黑杨抗逆育种工作提供备选材料和理论支持。