微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是一种重要的环境污染物,它是由淡水蓝藻产生的一类环状七肽天然毒素,具有肝毒性、肾毒性、神经毒性、胃肠毒性和肺毒性。本实验室率先发现MCs具有雄性生殖毒性,通过急、慢性动物实验发现MC-LR(水体中分布最广、研究最多的一种MCs异构体)进入动物体后,会通过两种途径引发生精功能障碍:一、抑制睾酮的合成,使其内分泌系统紊乱,损伤睾丸组织,造成睾丸细胞凋亡,精子质量下降;二,直接作用于睾丸中精原细胞和支持细胞,破坏睾丸组织结构,引起精原细胞凋亡,造成精子质量下降。精原细胞在精子发生过程中具有重要作用,精原细胞的损伤将直接影响精子的发生。有文献证实miRNA在精子发生过程中起到非常重要的调控作用,同时在少精子症或者弱精子症患者的精浆中发现异常表达的miRNA。最新证据显示MC-LR可影响小鼠睾丸组织miRNA表达谱。因此本研究将从miRNA角度探讨MC-LR引起精原细胞的损伤机制,并尝试发现其中的分子靶点,作为可利用的分子标记物。第一部分MiR-541在MC-LR导致精原细胞损伤中的作用及其机制研究一、目的探讨miR-541在MC-LR引起精原细胞(GC-1)凋亡中的作用机制二、方法1.MC-LR对GC-1细胞中miR-541的表达影响(1)GC-1细胞均分7组进行各项指标的检测,即Control、0.5 nM、5 nM、50 nM、500 nM、1μM、10μM MC-LR组。(2)流式细胞术检测不同浓度MC-LR染毒24h引起的GC-1细胞凋亡。(3)不同浓度MC-LR染毒GC-1细胞,采用qPCR法检测miR-541,CDKN2B的mRNA表达水平;采用Western blot实验技术检测CDKN2B,MDM2,磷酸化MDM2,p53和磷酸化p53蛋白表达水平。2.miR-541在MC-LR引起精原细胞毒性中的作用机制研究(1)构建含CDKN2B与miR-541互补配对碱基序列的双荧光素酶报告基因重组质粒,验证miR-541与CDKN2B之间的靶向性关系。(2)调控GC-1细胞miR-541的表达,同时染毒500 nM MC-LR,培养24h,检测 miR-541,CDKN2B,MDM2,磷酸化 MDM2,p53 和磷酸化 p53 的表达水平。(3)采用FDA/PI双染法,流式细胞技术,确认MC-LR损伤GC-1细胞中miR-541的作用。三、结果1.MC-LR对GC-1细胞中miR-541的表达影响(1)采用流式细胞术检测细胞凋亡发现:随着MC-LR染毒浓度的提高,GC-1细胞的凋亡率也显著上升。(2)随着MC-LR染毒浓度的增加,miR-541的表达量逐渐升高,CDKN2B随着MC-LR染毒浓度的增加而降低,MDM2,磷酸化MDM2随着染毒增加而降低,磷酸化p53随着染毒增加而增加。2.MiR-541在MC-LR引起精原细胞毒性中的作用机制研究(1)通过双荧光素酶报告基因实验证实CDKN2B是miR-541的靶基因。(2)通过FDA/PI双染法,流式细胞仪技术发现:当细胞中miR-541水平显著下调后,同时500 nM MC-LR染毒GC-1后,细胞凋亡没有发生显著变化。四、结论1、体外实验证实,MC-LR对精原细胞(GC-1)具有毒性,可通过上调GC-1细胞中miR-541的表达,导致细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白CDKN2B表达下调,引起下游p53蛋白磷酸化上调,并最终导致GC-1细胞发生凋亡。2、在GC-1细胞中,下调miR-541的表达可以抑制MC-LR导致的GC-1细胞凋亡。第二部分miR-541在MC-LR导致动物睾丸组织损伤的作用及其机制研究一、目的通过动物实验验证,miR-541在MC-LR引起睾丸组织损伤过程中的作用机制二、方法1.MC-LR对睾丸组织的毒性研究(1)30只6周龄的雄性Balbc小鼠随机分为四个大组即正常对照组(Control)、低剂量组(7.5 μg/(kg.weight)MC-LR)、中高剂量组(15 μg/(kg.weight)MC-LR)、高剂量组(30 μg/(kg.weight)MC-LR)。腹腔注射给药,Control给予同样体积的生理盐水。分别于2周后,颈椎脱臼处死小鼠,取双侧睾丸备用。HE染色观察小鼠睾丸结构,TUNEL法检测睾丸组织细胞凋亡情况。(2)检测 caspase 3,Cyt c,Bax,PP2A,磷酸化PP2A,Bcl-2,磷酸化Bcl-2 水平的变化。(3)通过免疫组化技术,检测Caspase 3,Bax和磷酸化BCL-2在组织中的表达情况。2.MC-LR引起睾丸组织损伤过程中,调控miR-541的表达对下游蛋白的表达和细胞功能的影响(1)不同浓度组MC-LR处理小鼠2周后,检测miR-541,CDKN2B,MDM2,磷酸化MDM2,p53和磷酸化p53表达水平。(2)将30只6周龄的雄性Balbc小鼠随机分为六个大组,即a组、b组、c组、d组e组和f组,即上调miR-541病毒(Lenti-miR-541 mimic)组、上调病毒阴性对照(Lenti-mimic-NC)组、下调 miR-541 病毒(Lenti-miR-541 inhibitor)组、下调病毒阴性对照(Lenti-inhibitor-NC)组、下调 miR-541病毒(Lenti-miR-541 inhibitor)组和下调病毒阴性对照(Lenti-inhibitor-NC)组。其中,e组和f组组经睾丸输精小管给药一周后,腹腔注射15 ug/(kg.weight)MC-LR两周;a组、b组、c组和d组经睾丸输出小管给药一周后,腹腔注射等量生理盐水两周。颈椎脱臼处死小鼠,取双侧睾丸备用。HE染色观察小鼠睾丸结构,TUNEL法检测睾丸组织细胞凋亡情况。(3)检测CDKN2B,MDM2,磷酸化MDM2,p53和磷酸化p53蛋白表达水平。(4)通过免疫组化技术,检测CDKN2B在组织中的表达情况。三、结果1.MC-LR对睾丸组织的毒性研究(1)MC-LR染毒2周后,15μg/(kg.weight)组睾丸组织出现结构松散,细胞脱落的现象;30 μg/(kg.weight)组睾丸组织出现明显的结构松散,细胞脱落的现象,精子数量明显减少。(2)TUNEL法检测睾丸组织切片凋亡状况,结果发现,随着染毒剂量的加大,睾丸组织细胞凋亡的比例显著上升。(3)在 15 和 30μg/(kg·weight)组,Caspase 3,Bax 和磷酸化 Bcl-2 表达水平显著上升。(4)免疫组化结果表明,在睾丸组织中,15μg/(kgweight)组,Caspase 3,Bax和磷酸化Bcl-2表达水平显著上升3.MC-LR对睾丸组织中miR-541的表达影响及其调控探究(1)15和30μg/(kg-weight)组睾丸miR-541的表达发生显著上调。睾丸中CDKN2B蛋白的表达显著下调。(2)抑制睾丸中miR-541的表达后,同时15μg/(kg·weight)MC-LR染毒,睾丸细胞凋亡较对照的15μg/(kg-weight)MC-LR染毒组有明显改善。四、结论1.MC-LR会导致小鼠睾丸组织中miR-541的表达上升,CDKN2B蛋白表达下调,p53蛋白磷酸化水平上升,最终引起睾丸组织损伤,生精障碍;2.下调睾丸组织中miR-541的表达可以有效抑制MC-LR引起的睾丸细胞凋亡。本研究的特色与创新之处:1、率先发现了 miR-541在MC-LR引起的GC-1细胞凋亡和睾丸组织损伤过程中发挥重要作用,并确认了 miR-541与CDKN2B之间的靶向关系。2、提出了 miR-541在MC-LR引起GC-1细胞凋亡过程中的分子机制。3、建立小鼠MC-LR染毒模型,研究miR-541的表达与精子发生之间的关系,证实miR-541会导致睾丸组织损伤,并证明抑制其表达有助于抑制MC-LR引起的睾丸损伤,为相关的临床治疗提供理论依据。