【摘 要】
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第一部分纳米铜颗粒对卵巢颗粒细胞的毒性损伤作用【目的】分析颗粒细胞在CuNPs暴露前后细胞表型的改变,即细胞增殖活性、细胞凋亡率、线粒体膜电位和氧化应激参数,证明CuNPs对颗粒细胞产生氧化应激损伤。【方法】根据课题组前期结果,在体外培养颗粒细胞系（the human ovarian granulosa tumor cell,COV434）,用含不同浓度的CuNPs处理或不做任何处理（对照组）,在
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第一部分纳米铜颗粒对卵巢颗粒细胞的毒性损伤作用【目的】分析颗粒细胞在CuNPs暴露前后细胞表型的改变,即细胞增殖活性、细胞凋亡率、线粒体膜电位和氧化应激参数,证明CuNPs对颗粒细胞产生氧化应激损伤。【方法】根据课题组前期结果,在体外培养颗粒细胞系（the human ovarian granulosa tumor cell,COV434）,用含不同浓度的CuNPs处理或不做任何处理（对照组）,在相应的时间点获取细胞样本用于后续检测处理。用CCK-8（cell counting kit-8）法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位,使用多功能酶标仪检测细胞内氧化应激标志物水平。【结果】与对照组相比,CuNPs暴露后COV434细胞的增殖活性均降低,并随着CuNPs的浓度和处理时间的增加而下降。COV434细胞与CuNPs共孵育12 h后,CuNPs对COV434细胞的半数生长抑制浓度是150μg/ml;细胞凋亡率增加和线粒体膜电位发生下降。与对照组相比,CuNPs处理组的氧化产物如ROS、脂质过氧化产物—MDA显著升高;抗氧化防御反应的标志物,如SOD和过氧化氢酶（catalase,CAT）活性降低,谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH）含量降低。【结论】CuNPs对颗粒细胞的毒性损伤作用存在氧化应激过程,并且CuNPs诱导的氧化应激损伤可能与线粒体依赖的细胞凋亡相关。第二部分HO-1在纳米铜颗粒诱导的细胞氧化应激损伤中的潜在保护作用【目的】基于第一部分结果,发现CuNPs在COV434细胞系中诱导氧化应激损伤。本实验旨在初步探索CuNPs暴露前后细胞内血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1,HO-1）相关蛋白通路的表达变化,并验证HO-1在CuNPs诱导的损伤模型中通过激活抗氧化防御系统对颗粒细胞产生保护作用。【方法】构建COV434细胞的CuNPs暴露模型,用CuNPs处理或者不做任何处理（对照组）,在相应时间点收集细胞。蛋白印迹法检测丝裂原激活的蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14）、磷酸化MAPK14（phosphorylated MAPK14,p-MAPK14）、核因子红系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor2,Nrf2）、Kelch样ECH相关蛋白1（kelch like ECH associated protein 1,Keap1）、HO-1和NAD（P）H醌脱氢酶1（NAD（P）H quinone dehydrogenase 1,NQO1）蛋白的表达。使用血红素（hemin）对COV434细胞进行预处理构建HO-1过表达模型,用锌原卟啉（Znpp）抑制HO-1活性,再分别检测该模型中CuNPs暴露前后的氧化应激标志物表达变化。【结果】与对照组相比,CuNPs处理后HO-1蛋白表达显著升高,Nrf2蛋白表达增加,同时Keap1蛋白表达显著降低;而NQO1蛋白在CuNPs处理前后表达并无显著差异;检测到HO-1蛋白呈动态表达,在12 h时HO-1蛋白开始明显表达增加,至24 h内持续表达增加,30 h时表达骤降。与对照组相比,CuNPs处理后p-MAPK14蛋白表达增加,在6 h时开始表达上升,9 h时继续上升;而MAPK14总蛋白,CuNPs处理前后表达并无显著差异。在CuNPs处理的细胞中,hemin预处理的细胞比未做预处理的ROS生成量明显降低,GSH水平明显增加和SOD2蛋白表达上调;同样地,在CuNPs处理的细胞中,Znpp预处理的细胞较未做预处理的ROS生成量明显增加。【结论】COV434细胞暴露于CuNPs后,HO-1蛋白表达增加,MAPK14/Nrf2信号通路激活。表明在CuNPs诱导的COV434细胞损伤作用中,HO-1蛋白的高表达可能是通过MAPK14/Nrf2信号通路激活介导的。体外HO-1干预实验表明,HO-1的高表达在抗氧化损伤中起到了重要的作用。
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