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叶酸拮抗剂（antifolates）作为一类重要的抗代谢药物,在抗肿瘤、抗菌、抗真菌及抗炎方面都发挥重要作用。已上市的多个药物,如甲氨喋呤（methotrexate）、培美曲塞（pemetrexed）、雷替曲塞（raltitrexed）和2009年获批的普拉曲沙（pralatrexate）作为抗肿瘤化疗药物已广泛被国内外临床使用,其中培美曲塞2012年全球销售额达25.94亿美元。叶酸拮抗剂的细胞内靶点主要包括二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,DHFR）和胸苷酸合成酶（thymidylate synthase,TS）。例如,甲氨蝶呤和普拉曲沙是典型的DHFR抑制剂,培美曲塞和雷替曲塞则主要抑制TS。DHFR在细胞内催化二氢叶酸还原为四氢叶酸,而TS是催化单磷酸脱氧尿苷（deoxyuridine monophosphate,dUMP）从头合成（de novo biosynthesis）单磷酸胸腺嘧啶核苷（thymidine monophosphate,dTMP）所需的酶。抑制DHFR和TS将引起胞内还原态叶酸不足或者“胸苷酸缺陷状态”（thymineless state）,从而使得细胞无法完成精确的DNA复制,最终导致细胞死亡。除DHFR和TS外,嘌呤从头合成中依赖叶酸发挥作用的两个酶,甘氨酰核苷酸甲基转移酶（β-glycinamide ribonucleotide formyltransferase,GARFTase）和5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸甲基转移酶（5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase,AICARFTase）也可以作为叶酸拮抗剂的靶点。已上市叶酸拮抗剂如甲氨蝶呤、普拉曲沙和雷替曲塞,其作用靶点比较单一,主要抑制DHFR和（或）TS,临床使用一定周期后肿瘤细胞易通过突变或过度表达的方式对其产生耐药性。培美曲塞则是第一个被确定为多靶点抗肿瘤药物的叶酸拮抗剂,其细胞内主要靶点为TS,还包括DHFR、GARFTase和AICARFTase。尽管多靶点的培美曲塞与其他单一靶点的叶酸拮抗剂相比不易耐药,由于其缺乏对肿瘤组织的选择性,在临床使用中仍会产生严重的毒副作用。在前期工作中,本课题组报道了一系列6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物。该系列化合物可选择性被PCFT转运至细胞内,而不依赖RFC转运,从而对肿瘤细胞产生选择性。其中1a抑制KB细胞和IGROV1细胞的IC50分别为3.22 nM和122.7 nM。其细胞内作用靶点是嘌呤生物合成中依赖叶酸的GARFTase。本课题在前期工作基础上,以兼具转运选择性和细胞内多靶点的化合物1a为结构基础,设计并合成一系列新化合物,以期通过改造化合物1a的结构,使其在保持现有转运选择性和细胞内靶点的前提下,对叶酸循环中的其他重要酶产生抑制作用,增强其抗增殖活性。目的:建立吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物的合成方法,完成目标化合物的合成,优化反应条件,并对目标化合物进行体外抗肿瘤活性筛选。方法:4-氯乙酰乙酸乙酯（11）与2,6-二氨基-4-氧嘧啶（12）环合后生成2-（2-氨基-4-氧-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶）乙酸乙酯（13）。中间体13经氢氧化钠溶液水解后再经稀盐酸酸化得2-（2-氨基-4-氧-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶）乙酸（14）。以1-羟基苯并三唑（HOBt）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI）作为缩合剂,中间体14分别与对氨基苯甲酸甲酯、对氨甲基苯甲酸甲酯、4-（（甲氨基）甲基）苯甲酸甲酯、5-氨基呋喃-2-甲酸甲酯缩合,得到的化合物经过氢氧化钠溶液水解后再经稀盐酸酸化分别得中间体17a-17d,中间体17a-17d,在2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪（CDMT）和N-甲基吗啉（NMM）的催化下与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐缩合,得到的化合物再经过水解并酸化后得到目标化合物1-4。中间体13经三乙基硼氢化锂（LiEt3BH）还原得2-氨基-6-（2-羟乙基）-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-酮（22）。中间体22以甲磺酰氯作为磺酰化试剂发生磺酰化反应,得中间体（2-氨基-4-氧-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基）乙基甲磺酸酯（23）。中间体23与叠氮化钠发生亲核取代反应得关键中间体2-氨基-6-（2-叠氮乙基）-3,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-酮（24）。带有叠氮基团的化合物24以DIPEA作碱,在一价铜的催化下分别与三种不同的端基炔酸酯或端基炔酸发生点击反应,得到的化合物经过氢氧化钠溶液水解后再经稀盐酸酸化分别得到中间体27a-27c,中间体27a-27c在2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪（CDMT）和N-甲基吗啉（NMM）的催化下与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐缩合,得到化合物再经过水解并酸化后得到目标化合物5-7。中间体27a与不同的氨甲基吡啶缩合得到目标化合物8-10。通过高分辨质谱、核磁共振氢谱和碳谱等方法对目标化合物和重要中间体进行结构确认。选用口腔表皮样癌细胞（KB）、人体乳腺癌细胞（MCF7）和结肠癌细胞（SW620）为实验对象,以经典叶酸拮抗剂PMX和MTX作为阳性对照品,对目标化合物1-7开展体外抗肿瘤活性测试。采用核苷（腺苷和胸苷）/AICA（5-氨基咪唑-4-甲酰胺）对KB细胞进行保护实验,观察KB细胞增殖的情况,从而确定目标化合物的作用靶点。结果:按照所设计的合成路线成功合成了目标化合物10个,关键中间体13个,通过质谱、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱等方法对重要中间体及目标化合物进行了结构确认,并对合成路线进行了优化。完成化合物1-5的体外抗肿瘤活性测试和化合物1的作用机制研究。结论:所合成的目标化合物具有良好的抗肿瘤活性,其中化合物1抑制KB细胞的IC50为7.5 nM,优于阳性对照品MTX和PMX,抑制SW620和MCF7细胞的IC50分别为0.98μM和1.13μM。