一、研究背景恶性肿瘤是世界范围内常见病、多发病之一,其对人类的危害日益显得突出,当前是危害生命健康,导致死亡的首要原因。根据世界卫生组织(WHO)的报告,2000年全球癌症死亡例数已经超过了700万,占全球死亡人数的12%,如果这一趋势得不到改善,预期到2020年每年新发病例数将达到1500万。随着对肿瘤分子生物学的理解,现代分子生物学和生物工程技术的发展,以及生物反应调节剂概念的提出,肿瘤的生物治疗成为继手术、化疗、放疗三大治疗手段之后的第四种肿瘤治疗模式。生物反应调节剂(Biological responsemodifiers)是能够直接或者间接增强宿主抗肿瘤作用,或者增强宿主细胞对细胞毒性物质耐受能力的一类药物。现有的研究表明,化疗联合应用生物反应调节剂不仅可以减轻化疗的毒副作用,还可以激活机体免疫系统,从而提高肿瘤患者生活质量和远期治愈率及延长生命。生物反应调节剂的范围很广,细菌制剂是其中之一。众多的细菌制剂中,链球菌及提取物在抗肿瘤方面的应用有着一定的历史和优势,20世纪50年代,Koshimura、Ohta、Harvas均证实A族溶血性链球菌有很强的抗肿瘤能力。日本科学家从链球菌培养物中提取的OK-432,已经成为很好的抗肿瘤药物。我国方亮教授从α-溶血性链球菌代谢产物中提取的甘露聚糖肽,临床应用于肿瘤的辅助治疗,在减轻放化疗对造血系统及胃肠道反应和免疫功能低下方面,疗效得到了患者的认可,对其机制的研究也比较透彻。近几年来,随着空间技术的发展及空间育种的成熟,人们开始利用太空环境中微重力、强电离辐射、高度真空状态等特殊环境可以引起生物体DNA链断裂、基因突变、细胞分化异常的特性,来筛选具有高产高效抗肿瘤药物。太空链球菌是搭载过神舟一号、神舟二号、神舟三号飞船【内部提供】经过太空复杂环境诱变后,筛选出的性状优良的正变异菌种,与普通菌种比较,其形态特征,生长条件,其溶血现象及产酸现象均有不同。应用全细胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基因组DNA限制性酶切对其遗传性状和蛋白表达情况进一步研究发现,细菌蛋白图谱存在存在明显差异。其中在97KD分子量附近有三条带有差异;在66KD分子量附近有一条带有差异;在20-31KD分子量之间有一条带有差异;菌株的基因组DNA限制性酶切/PFGE图谱中SmaI的酶切指纹图谱有一条带的差异。经过太空诱变后的链球菌种已经通过中国科学院微生物研究所检测验定报告,是具有自主知识产权的优良微生物菌种。其遗传性状的差异决定了产物结构的改变,进而决定产物的功能的改变,经过太空诱变后的链球菌发酵物(已经通过陕西省药品检验所鉴定)与普通链球菌发酵物也有不同。我们通过观察太空链球菌发酵物对化疗后外周血白细胞、骨髓有核细胞数量的影响及化疗后胸腺、脾脏等免疫器官和肿瘤大小变化及对腹水型荷瘤小鼠生存期的影响来初步了解太空链球菌发酵物的作用效果,为其在化疗减毒增效方面的临床应用提供理论基础。第一章太空链球菌发酵物联合化疗对S180肉瘤小鼠肿瘤生长抑制作用和对生存期影响的观察目的:观察太空链球菌发酵物联合化疗对S180荷瘤小鼠肿瘤生长抑制情况和腹水型荷瘤小鼠生存期的影响。方法:无菌抽取腹腔传代第7d的S180肉瘤小鼠腹水,为乳白色,1000rpm离心5分钟,弃去上清,台盼蓝染色细胞活力＞95%,将细胞在倒置相差电子显微镜下计数细胞数,用灭菌生理盐水稀释调节细胞浓度达到2×10~7/ml,用于小鼠右侧背部皮下肿瘤接种,每只小鼠接种0.1ml。观察7天左右肿瘤直径大小约1cm,实验动物随机分为6组,每组9只分别为A:空白对照组B:生理盐水组C:环磷酰胺化疗组D:环磷酰胺化疗联合太空链球菌发酵物中浓度组E:环磷酰胺化疗联合太空链球菌发酵物高浓度组F:环磷酰胺化疗联合甘露聚糖组。给药分别为A:空白,B生理盐水0.5ml,C环磷酰胺100mg/kg×3日,D环磷酰胺100mg/kg×3日+太空链球菌发酵物80mg/kg×12日,E环磷酰胺100mg/kg×3日+太空链球菌发酵物100mg/kg×12日,F环磷酰胺100mg/kg×3日+甘露聚糖100mg/kg×12日。末次给药后24小时处死小鼠,肿瘤组织称重。按照公式计算抑瘤率。对腹水型荷瘤小鼠生存期影响分组方法:无菌条件下抽取小鼠乳白色腹水,计数后调整至1×10~7个/ml,腹腔注射0.5ml,共接种28只小鼠,接种第二日随机将小鼠分为4组,每组7只,分别为空白组、环磷酰胺组(100mg/kg)、太空链球菌发酵物100mg/kg组,甘露聚糖100mg/kg组,接种第3日开始给药并计算生存期,环磷酰胺组给药1天,太空链球菌发酵物、甘露聚糖分别连续给予9天,观察小鼠生存期的变化。结果:应用One-Way ANOVA方差齐性检验后发现方差不齐,经过Welch近似方差分析齐性检验后应用Dunnett统计方法检验,认为各组间统计学差异显著(F=40.121,P=0.000)。化疗过程同时联合应用不同浓度太空链球菌发酵物,其肿瘤抑制作用表现明显不同,化疗联合相同浓度的太空链球菌发酵物和甘露聚糖其肿瘤抑制率明显不同,分别为80.3%和60.9%。对腹水型小鼠的生存期的影响也有不同差异,单纯应用化疗后其小鼠生存期明显缩短,应用K IndependentSamples Test统计方法检验,认为组间统计学差异显著(λ~2=23.903,P=0.000)。结论:太空链球菌发酵物联合环磷酰胺化疗抑制肿瘤生长作用明显;太空链球菌发酵物可明显延长腹水型荷瘤小鼠生存期。第二章:太空链球菌发酵物联合化疗后对骨髓抑制的影响目的:通过观察太空链球菌发酵物对应用环磷酰胺化疗后引起骨髓抑制的小鼠外周血白细胞和骨髓有核细胞数量的变化,了解太空链球菌发酵物对骨髓抑制的保护作用。方法:造模方法同上,随机小鼠分为6组,每组10只。分别分为空白对照组、环磷酰胺化疗组、环磷酰胺化疗联合太空链球菌发酵物低、中、高浓度组和甘露聚糖阳性对照组。太空链球菌发酵物低、中、高浓度组,浓度分别为40、80、100mg/kg,阳性对照组应用甘露聚糖100mg/kg。除荷瘤对照组外每组每只小鼠腹腔注射环磷酰胺40mg/kg,连续5天,同时给后三组按照以上浓度给予药物,荷瘤对照组给予同体积生理盐水,连续12天,于末次给药24小时后取外周血计数,次日处死小鼠后剥离左侧股骨,冲洗骨髓后常规条件下计数。结果:化疗后小鼠外周血细胞、骨髓有核细胞均下降明显,应用太空链球菌发酵物和甘露聚糖后各组小鼠白细胞和骨髓有核细胞均呈不同程度的升高,统计学差异显著(F=64.8 P=0.000＜0.01,F=31.9 P=0.00＜0.01),其中以中、高浓度和甘露聚糖组升高外周血明显,与化疗组比较统计学差异显著(P均为0.000,小于0.01),升高骨髓有核细胞作用也具有随着太空链球菌浓度增加而增加趋势。结论:太空链球菌发酵物同样具有升高外周血白细胞和骨髓有核细胞数量的作用。而且在一定浓度范围内,随着太空链球菌发酵物剂量的增加,其升高外周血和骨髓有核细胞的作用逐步增强的趋势。第三章太空链球菌发酵物联合化疗后对免疫器官的保护作用实验观察目的:通过观察太空链球菌发酵物对化疗后引起骨髓抑制的小鼠胸腺、脾脏的变化,以及脾脏组织免疫细胞的变化,了解太空链球菌发酵物对免疫器官保护。方法:同第一章结果:小鼠化疗过程配合给予甘露聚糖及太空链球菌发酵物后胸腺指数、脾脏指数也有不同程度的提高(F=13.873 P=0.000,F=21.919 P=0.000),对脾脏淋巴细胞也有保护和促进增生作用(F=33.488,P=0.000,F=20.913 P=0.000)。结论:经过太空诱变后遗传性状、蛋白表达改变的链球菌发酵物同样具有保护脾脏、胸腺等免疫器官的作用。