奶牛乳腺炎对奶牛产业发展威胁巨大，不仅造成经济损失，还危害消费者健康。全世界各种类型乳腺炎患病率达到50%。我国是奶牛养殖大国，奶牛乳腺炎危害严重。病原微生物是引起乳腺炎的最主要原因，金黄色葡萄球菌是导致乳腺炎的重要致病菌。金葡菌能反复感染组织，释放的外毒素可引起全身症状，导致奶牛死亡。目前治疗奶牛乳腺炎的主要方法是应用抗生素类药物，但是长时间的抗生素治疗，会使细菌产生抗药性。金葡菌耐药性菌株的产生使得其更加不易治愈。抗生素还会在乳汁中残留，产生药物残留问题。金葡菌感染能引起炎症、细胞凋亡，还能逃避免疫。因此，对金葡菌性乳腺炎的治疗应考虑抗炎、减少细菌诱导的细胞凋亡，增强天然免疫系统的杀菌作用。抗炎疗法是治疗临床型乳腺炎的重要方法。在应用抗生素杀灭或抑制细菌的同时，应配合抗炎药来控制炎症，减轻剧烈的炎症反应造成的组织损伤。另外减少细胞的死亡和增强机体天然免疫系统的效能也对治疗有重要意义，增强免疫细胞对细菌的杀灭，通过减少细菌数量缓解炎症和细胞死亡的发生。近年来中草药治疗奶牛乳腺炎受到广泛关注。中草药的纯化提取物作为商品化药物制剂也应用于奶牛乳腺炎的治疗。中草药和其提取物可通过其具有的杀菌、抑菌作用，抗炎调节机体免疫的作用，既可单独使用，也可以配合其他药物使用，甚至可以减少抗生素的用量。甜菊苷是从菊科植物甜叶菊的叶子中提取的天然甜味剂，安全性高、无毒副作用，在美国、欧洲、巴西、韩国、日本和我国，甜菊糖已经被广泛用于食品添加剂。甜菊苷本身具有一些治疗性的功效，例如抗高血糖、抗高血压、抗炎和调节免疫力等。本实验旨在从多方面探索甜菊苷保护性作用的机制。鉴于使用本体动物牛进行动物实验成本过高且不人道，我们使用小鼠建立金葡菌感染乳腺的急性动物模型。通过动物模型实验，采用组织学观察、TUNEL凋亡染色、ELISA、蛋白免疫印迹和荧光定量PCR等方法，研究甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺组织在病变、炎症和细胞凋亡方面的影响。实验发现，金葡菌感染小鼠乳腺组织后，组织发生炎症，炎性细胞因子分泌量升高，炎性信号通路和凋亡蛋白的活性升高，而甜菊苷在300,100,33mg/kg的浓度下减轻了炎症反应和细胞凋亡，影响了NF‐κB和MAPK炎性信号通路蛋白和细胞凋亡蛋白的活性。乳腺上皮细胞是乳腺组织最主要的功能性细胞，为进一步确证甜菊苷对金葡菌感染细胞的保护作用，我们分离纯化了小鼠乳腺上皮细胞，进行体外细胞实验。先进行甜菊苷孵育后，再给予金葡菌刺激，检测了炎性细胞因子的变化情况和NF‐κB、MAPK以及凋亡蛋白的变化，发现甜菊苷在300,100,33μg/ml的浓度下抑制了NF‐κB、MAPK通路的主要蛋白p65、p38等的磷酸化和凋亡蛋白caspase‐3、BAX的活化水平，进而减少了炎性细胞因子的分泌。TLR2功能之一就是识别金葡菌，并能够启动和调节下游炎症和细胞凋亡信号。我们探讨了在组织和细胞中甜菊苷对TLR2表达的影响，结果显示，金葡菌感染时甜菊苷抑制了TLR2蛋白和mRNA表达水平，因此，TLR2对下游相关信号的激活也受到影响。细胞实验的结果显示，随着TLR2的过度表达被抑制，其下游炎症相关信号通路NF‐κB、MAPK和凋亡相关蛋白的磷酸化水平、活化程度也受到抑制，影响了炎症和细胞凋亡的激活。对小鼠乳腺上皮细胞进行活/死细胞染色检验，结果显示甜菊苷通过调节TLR2及其下游信号，减少了细胞死亡数量，起到了保护细胞的作用。另一方面，提高天然免疫系统对细菌的杀灭作用也是控制疾病的途径。为了研究甜菊苷对天然免疫系统的影响，我们检测了甜菊苷和中性粒细胞NETs网的联合作用后细菌生长、炎性因子和相关蛋白的变化。分离纯化了中性粒细胞后，将中性粒细胞生成的NETs网与甜菊苷共同作用于小鼠乳腺上皮细胞，再给予金葡菌刺激，以模拟金葡菌感染时天然免疫系统的部分作用效果。结果表明，甜菊苷和NETs网联合作用时对细菌生长的抑制和对炎症、细胞死亡的抑制效果都强于二者单独作用。这说明甜菊苷对天然免疫系统中性粒细胞NETs网之间具有有协同作用。综上所述，通过动物实验和体外细胞实验结果表明，甜菊苷对金葡菌感染的乳腺组织具有抗炎和抗凋亡的保护作用，并且能够与NETs网协同，增强乳腺组织免疫力。甜菊苷作为安全无毒的天然甜味剂，在药用价值上有一定的潜力，具有一定的辅助治疗效果。希望本论文研究结果能够为金葡菌性奶牛乳腺炎的临床治疗和抗炎、保健药品的开发提供一定的帮助。