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氧是生命活动的基本物质之一,而氧的代谢和利用一直是生命科学研究中的活跃领域。众所周知,人体内存在两种与氧密切相关的球蛋白:血红蛋白(hemoglobin,HGB)和肌红蛋白(myoglobin,MGB)。它们是机体实现氧的储存、利用、转运、线粒体有氧活动及活性氧的清除等过程中的重要载体。成人脑虽然仪占体重的2%,但其有氧代谢非常活跃,耗氧量占人体总耗氧量的20%左右。那么神经系统中是否存在一种特异性的携氧蛋白以促进脑的氧和能量代谢呢?这一问题激起了科研工作者的广泛兴趣。2000年Burmester~[1]等首次报道,脊椎动物神经系统内存在第三种单体携氧珠蛋白——脑红蛋白(neuroglobin,NGB),它住皮层神经元及视网膜中呈高表达,提示其可能参予了神经系统氧与能量的代谢活动,为神经系统氧利用的研究带来新的曙光。已有的研究结果显示~[2-6]:缺氧可以诱导NGB表达上调,同时,高表达NGB有助于神经组织耐受缺氧损伤,而抑制NGB表达则会加重其损伤程度。以上研究为NGB作为内源性神经保护因子提供了论据,为治疗缺氧性神经损伤提供了新思路。在神经外科的临床工作中,颅脑创伤是最常见的病种之一。创伤后脑组织水肿,对氧的摄取和利用明显下降是引起脑损伤的重要因素。而NGB作为神经系统特有的携氧球蛋白,研究其在神经系统机械性损伤中的表达和作用,将为临床工作中对颅脑创伤的诊断、治疗提供新的契机和切入点。本研究包括:1、建立体外培养原代神经元机械性损伤模型:手术取胎鼠人脑皮层,分离纯化后作原代神经元培养:用抗神元特异性蛋白——神经丝蛋白(Neurofilament protein,NF)抗体鉴定细胞纯度;对Banker体外损伤模型进行改良,采用自行设计的模版对培养神经元进行机械性损伤,并在损伤后行光镜下观察及免疫组化检测c-Fos蛋白来证实神经元的损伤。2、分别采用免疫组织化学、Western Blot技术检测神经元损伤后NGB的表达变化:神经元NGB染色采用链霉素抗生物素-过氧化物酶连接法(SP法),并采用图像分析技术(Image J软件,美国国立卫生院--NIH)观测损伤前、后不同时间点神经元的NGB免疫组化反应阳性信号的灰度值;细胞裂解提取蛋白后,采用Western Blot技术检测神经元损伤前、后各时间点NGB的表达。两种检测方法的结果一致。3、增加NGB的表达对损伤神经源性细胞活性的影响:因神经元的转染率低,因而采用转染率高的神经源性细胞(B104细胞)进行实验。先按照损伤模型对B104细胞进行机械性损伤,采用Western Blot技术检测B104细胞损伤后NGB的表达变化,确定其变化趋势与原代神经元相同;然后采用军事医学科学院二所十三室制备的pCMV-Myc-NGB质粒转染B104细胞,用Western Blot检测技术验证B104细胞转染pCMV-Myc-NGB质粒后NGB表达增多:选取损伤后0.5h、2h两个时间点,分别测定并比较未转染组、空质粒转染组及pCMV-Myc-NGB质粒转染组的乳酸脱氢酶(LDH)活性及MTT细胞活性,证明了高表达NGB对机械性损伤后的神经源细胞具有保护作用。4、大鼠急性局灶性脑损伤分级模型的建立:改进Feeney s自由落体模型装置并制作大鼠急性局灶性脑损伤模型,以不同冲击力(200gcm、600gcm、1000gcm)致大鼠脑损伤,鼠脑切片后并用TTC染色,采用Image J软件计算各组损伤后坏死脑组织的体积,经比较存在组间差异5、大鼠急性局灶性颅脑损伤后血清NGB的水平变化:自行制备NGB双抗夹心ELISA检测试剂盒;测定伤后轻、中、重各组脑损伤血清中的NGB含量并比较差异,证明了血清中NGB水平脑损伤程度呈正相关;测定同一损伤程度下,损伤后各时间点血清NGB的水平,显示了损伤后血清中NGB水平的变化趋势。综上所述,通过体外实验,本研究证实单纯的机械性损伤可以刺激神经元脑红蛋白表达上调,在机械性神经损伤中,脑红蛋白具有神经细胞保护功能,为基于此保护机制研发新的神经保护药物用于脑损伤的治疗提供了依据;通过在体实验,初步证明脑损伤后血清NGB水平与损伤程度的关系,及脑损伤后血清NGB水平的时间变化趋势,为临床上能够量化判断脑损伤的严重程度、转归与预后奠定了基础。