目的肿瘤患者接受化疗所引起的中性粒细胞缺乏症(Cancer chemotherapy-induced neutropenia, CCIN)是化疗最常见的副作用之一。CCIN的发生将会导致患者的机体免疫力下降,易引发感染,严重的CCIN患者可因发生院内感染而死亡。粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor,GCSF)是目前临床上治疗CCIN的主要药物。但是研究发现GCSF诱导造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSC)分化形成大量的中性粒细胞不具备完善的杀菌功能,所以GCSF并不能有效地降低CCIN患者的感染率及感染所致的死亡率。因此,目前临床上CCIN的治疗亟需寻找更有效的策略。维甲酸衍生物他米巴罗汀(又称Am80)是一种选择性的维甲酸受体激动剂,在临床上被用于治疗急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL)。研究表明Am80具有促进HSC粒性分化的作用,且诱导产生的中性粒细胞在体外具有强大的杀菌功能。但是Am80诱导中性粒细胞再生的能力以及再生细胞在体内的抗菌作用均未见报道。而Am80诱导再生的细胞可否满足CCIN患者对中性粒细胞数量与质量的需求,也有待确认。本文首先考察了中性粒细胞减少、回升阶段以及长时间感染的存活实验中,单用Am80、GCSF和联合Am80-GCSF对CCIN小鼠抵抗细菌感染的作用；接着比较了三者诱导粒细胞前体细胞分化成中性粒细胞的能力和对所生成细胞杀菌功能的影响及作用机制；最后研究了它们对急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)患者骨髓样本的细胞增殖及诱导粒性分化的效果。本文对Am80-GCSF诱导中性粒细胞再生的作用及机制的研究,将为其成为治疗CCIN的新方案提供实验依据。方法1)在CCIN中性粒细胞数量减少阶段,Am80-GCSF对小鼠中性粒细胞抗菌作用的影响以C57BL6/J小鼠研究对象,第0天腹腔注射200 mg/kg的环磷酰胺(CPA)造成CCIN模型,第0至2天小鼠分别给以不同剂量的GCSF或Am80或Am80-GCSF,剂量设置为250、50、25μg/kg GCSF,5、1、0.5 mg/kg Am80及对应剂量的Am80-GCSF合用。第2天给药结束后通过腹腔注射或尾静脉注射金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus, S. Aureus)对小鼠造成感染。用血细胞计数仪Vetscan HM5检测白细胞和中性粒细胞的数量。采用腹腔清洗液或外周血或脾脏、心脏匀浆液倍比稀释后涂于羊血琼脂板,370C孵育过夜,统计板上的CFU计算存活细菌数量从而评价中性粒细胞的杀菌能力。分别采用Ficoll分离液和多浓度Percoll分离液对小鼠外周血和骨髓细胞进行分离,血细胞计数板结合台盼蓝染色法分析中性粒细胞数量及形态。采用Student’s unpaired two-tailed t-test分析定量结果的组间差异。2)在CCIN中性粒细胞数量回升阶段,Am80-GCSF对小鼠中性粒细胞抗菌作用的影响以C57BL6/J小鼠研究对象,第0天腹腔注射200 mg/kg的CPA造成CCIN模型,第2至4天小鼠分别给以25 μg/kg GCSF、0.5 mg/kg Am80或两者合用,同时第4天给药结束后通过尾静脉注射S. Aureus对小鼠造成感染。用血细胞计数仪Vetscan HM5检测白细胞和中性粒细胞的数量。采用感染后3h和16h外周血倍比稀释后涂于羊血琼脂板,37℃孵育过夜,统计板上的CFU计算存活细菌数量从而评价中性粒细胞的杀菌能力。分别采用Ficoll分离液和多浓度Percoll分离液对小鼠外周血和骨髓细胞进行分离,血细胞计数板结合台盼蓝染色法分析中性粒细胞数量及形态。,采用-Student’s unpaired two-tailed t-test分析定量结果的组间差异。3) Am80-GCSF对CCIN小鼠生存试验的作用生存试验以C57BL6/J小鼠研究对象,第0天腹腔注射200 mg/kg的CPA造成CCIN模型,从第0天或第1天开始,CCIN小鼠分别给以不同剂量的GCSF或Am80或Am80-GCSF,剂量设置为50、25μg/kg GCSF,1、0.5 mg/kg Am80及对应剂量的Am80-GCSF合用,持续给药至第8天。第3天,经尾静脉注射金黄色葡萄球菌,观察至第9天计算存活率。隔天记录小鼠体重,收集死亡小鼠脾脏进行重量及大小比较。第9天对存活的小鼠进行二次感染,革兰氏染色法检测外周血中性粒细胞对细菌的吞噬。采集第11天存活小鼠外周血,透射电镜观察小鼠中性粒细胞超微结构。分别采用Ficoll分离液和多浓度Percoll分离液对小鼠外周血和骨髓细胞进行分离,血细胞计数板结合台盼蓝染色法分析中性粒细胞数量及形态。采用Kaplan-Meier plots analysis分析小鼠存活曲线,存活曲线组间差异通过Log-rank test进行计算。采用Student’s unpaired two-tailed t-test分析定量结果的组间差异。4) Am80-GCSF对中性粒细胞再生的作用及机制研究以人脐带造血干细胞CD34+细胞、APL细胞株NB4细胞为研究对象。CD34+细胞药物浓度设置为：维甲酸(All trans-retinoic acid, RA) 0.5 μmol/L, GCSF 25 ng/mL, Am80 2.5 nmol/L及Am80-GCSF合用；NB4细胞药物浓度设置为：RA 1μmol/L, GCSF 25ng/mL, Am80 2.5 nmol/L及Am80-GCSF合用。采用血细胞计数板结合台盼蓝染色法检测细胞增殖,瑞氏吉姆萨染色法鉴定细胞核形态。中性粒细胞杀菌实验用于评价细胞杀菌能力。采用鲁米诺化学发光法检测fMLP和PMA刺激下细胞活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)的释放量。荧光定量PCR测定C/EBPα、C/EBPβ、CEBPε、RARβ2、CD18、p21Cip/Kip、CD66a、CD66b、CD66c等基因mRNA的转录水平。流式细胞术检测细胞膜表面的特异性抗原CD66-CD18的共表达水平。Student’s unpaired two-tailed t-test分析定量结果的组间差异。5) Am80-GCSF对原代AML病人骨髓细胞的作用及机制研究以临床AML骨髓样本为研究对象。采用Ficoll分离液分离单核细胞。药物浓度设置为：GCSF 25 ng/mL,Am80 20、50、150 nmol/L及相应Am80与GCSF合用。采用血细胞计数板结合台盼蓝染色法检测细胞增殖,瑞氏吉姆萨染色法鉴定细胞核形态。中性粒细胞杀菌实验用于评价细胞杀菌能力。采用鲁米诺化学发光法检测fMLP和PMA刺激下细胞活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的释放量。荧光定量PCR测定CEBPε、RARβ2、CD11b、CD66c等基因mRNA的转录水平。Student’s unpaired two-tailed t-test分析定量结果的组间差异。结果1)在CCIN中性粒细胞数量减少阶段,Am80改善小鼠体内的清除细菌能力我们在CCIN中性粒细胞数量减少阶段,分别比较了高、中、低剂量组中,单用GCSF、Am80和合用Am80-GCSF对小鼠体内细菌清除能力的影响。结果显示,在该阶段由于CPA的骨髓抑制作用,尽管所有浓度下的Am80不能诱导大量中性粒细胞产生,却显著地降低小鼠体内存活的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus,S.Aureus)数量,提示Am80诱导小鼠体内存在的粒细胞前体细胞有效地分化为具有杀菌作用的成熟中性粒细胞,从而增强了小鼠体内的清除细菌能力。2)在CCIN中性粒细胞数量回升阶段,Am80-GCSF联合诱导足量的具备杀菌功能的中性粒细胞产生CCIN小鼠中性粒细胞数量回升阶段的实验结果表明,Am80促粒细胞再生能力较差；GCSF虽然具备诱导大量中性粒细胞生成的能力,但产生的细胞分化程度不高；Am80-GCSF诱导大量分化完全的中性粒细胞生成,该组小鼠呈现出与Control组相似的清除细菌的能力。提示Am80-GCSF可能是通过协同Am80的分化能力与GCSF促进粒细胞前体细胞增殖的能力,从而诱导足量具有杀菌功能的中性粒细胞产生。3)Am80-GCSF降低CCIN小鼠细菌感染所致的死亡率存活实验显示,Am80-GCSF合用降低了细菌感染引起CCIN小鼠的死亡率,并延长了生存时间,而单用Am80或GCSF均无法产生同样的药效。通过分析存活小鼠中性粒细胞,我们发现GCSF小鼠产生大量中性粒细胞的骨髓内细胞密度与Control组相比存在差异。超微结构分析显示,GCSF组各有76.9%和27.5%的中性粒细胞分别出现了空泡和核膜分离,而Am80-GCSF组和Control组的中性粒细胞内鲜少出现上述现象；同时,Am80-GCSF组和Control组细胞内的颗粒数量明显多于GCSF组。另外,在给药第9天Am80-GCSF组的脾脏变大,外周血(Peripheral blood,PB)中中性粒细胞数量大量增加；但在第13天时该组的脾脏和中性粒细胞均恢复到接近Control组的水平。上述结果表明,Am80-GCSF促进粒细胞前体细胞增长但不引起过度增殖,同时它诱导细胞进行粒性分化,引起足量具有杀菌功能的中性粒细胞产生,因而提高了CCIN小鼠对S. Aureus的抵抗能力。4) Am80-GCSF促进中性粒细胞再生的作用比较RA.Am80和GCSF在CD34+细胞和NB4细胞模型中的作用,结果显示,RA无法引起CD34+细胞在fMLP刺激下释放ROS,GCSF不能引起NB4细胞分化和ROS释放,而Am80能诱导CD34+或NB4细胞粒性分化以及在fMLP刺激下ROS的释放。CD34+细胞的实验结果显示,2.5 nmoI/L Am80与25 μg/mL GCSF联合作用6天不会对C细胞造成增殖抑制,但Am80-GCSF使CD34+细胞的分化比例达到32.8%,明显高于单用组。通过比较吞噬细菌能力,我们看到Am80-GCSF组细胞清除细菌能力强于Control. Am80和GCSF组,同时提高了细胞在fMLP和PMA刺激后ROS的释放量。qRT-PCR结果显示,与Am80和GCSF相比,Am80-GCSF能更早上调RARβ2、C/EBPε、CD66b、CD66c、CD11b以及C/EBPβ的mRNA的表达,并在作用后期仍保持RARβ2和C/EBPε的mRNA高转录水平。另外,Am80-GCSF组CD66a与CD66b的mRNA水平在分化中期出现了大幅度的提升。流式细胞术检测结果表明,Am80-GCSF组细胞的膜表面特应性抗原CD66-CD18的共表达水平达到47%,显著高于药物单用组。提示Am80-GCSF促进中性粒细胞的再生过程是由C/EBPβ、C/EBPε和RARβ2共同参与的。而CD66-CD18信号通路的完善也为中性粒细胞杀菌功能的发挥奠定了基础。肿瘤细胞株NB4细胞结果显示,Am80-GCSF显著抑制NB4细胞增殖,促进细胞分化,使中性粒细胞的比例达到50%以上,同时大幅度增加了NB4细胞由fMLP或PMA刺激而释放的ROS总量。qRT-PCR检测结果提示,GCSF的参与使Am80-GCSF相较Am80更早上调RA目标基因的mRNA转录水平。5) Am80-GCSF对原代AML病人骨髓细胞的作用我们分别采用20或50 nmol/L的Am80与25 μg/mL GCSF联合作用于AML样本分离出的单核细胞。实验结果显示,Am80-GCSF抑制了细胞的增殖,同时显著提高细胞在fMLP和PMA刺激下ROS释放量。mRNA水平检测表明,Am80-GCSF在给药第2天显著地上调了RA相关基因RARβ2、C/EBPε和CD11b的转录水平,并使其在整个药物处理过程中保持一个高转录状态。我们进一步使用150 nmol/L的Am80与25 μg/mL GCSF联合作用于AML细胞。单用Am80和Am80-GCSF都对样本#S062615细胞增殖产生了明显的抑制作用。Am80-GCSF促进细胞的粒性分化,同时提高ROS的释放总量。细菌吞噬实验结果显示,Am80-GCSF处理组的原代细胞杀伤的细菌数量显著多于对照组和药物单用组。qRT-PCR检测发现,Am80-GCSF上调了RARβ2、C/EBPε和CD66c的mRNA水平,提示Am80-GCSF对原代AML细胞增殖和分化的调节可能与上调RA相关基因mRNA的作用有关。结论本文首次在体外与体内实验中研究了Am80协同GCSF诱导中性粒细胞再生的作用,并对机制进行初步探讨。Am80可有效促进粒性分化,但不会引起粒细胞前体细胞的增殖；而GCSF诱导产生了大量不具备成熟杀菌能力的中性粒细胞。二者合用不仅促进了粒细胞前体细胞增殖,同时将这些细胞诱导分化为具有杀菌功能的中性粒细胞。因而,Am80-GCSF的这种作用可以满足CCIN患者对具有抗菌作用的中性粒细胞的大量需求。而Am80-GCSF对粒细胞前体细胞增殖和分化的调控机制可能是由RARβ2、C/EBPβ和C/EBPε介导的,同时对CD66-CD18信号通路的完善增强了中性粒细胞免疫功能。本研究为Am80-GCSF合用成为有效治疗CCIN的临床新策略奠定了实验基础。