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第一部分:BMP-6在雌激素受体阳性乳腺癌细胞中的表达调控骨形态发生蛋白-6(Bone morphogenetic protein-6,BMP-6)属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员,其作用方式主要是通过与细胞膜上的BMP I型和II型受体结合,依靠Smad通路传递信号来调节细胞生长和分化。BMP-6是调控骨生长和器官发育的重要功能因子。除了在诱导成骨方面发挥重要作用外,近年来越来越多的研究表明BMP-6的表达与肿瘤的发生和转移密切相关。在乳腺癌细胞系和乳腺癌患者肿瘤标本中均发现BMP-6的表达。
依据雌激素受体表达状态不同,乳腺癌可分为雌激素受体阳性(ER+)和雌激素受体阴性(ER-)乳腺癌两种。雌激素是介导乳腺癌发生和转移的刺激因子。本实验室前期研究证实17β-estradiol(E2)能特异性激活乳腺癌细胞系MCF-7中BMP-6的mRNA水平表达。第一部分实验旨在探讨雌激素激活乳腺癌细胞中BMP-6基因转录的分子机制。本文通过使用不同浓度E2刺激人ER+乳腺癌细胞MCF-7,定量PCR检测BMP-6 mRNA表达水平,发现E2剂量依赖性地激活BMP-6 mRNA表达水平。BMP-6启动子上存在着ERα的潜在结合位点：一个1/2 ERE元件(-911/-906)和三个Sp1位点(-794/-788,-726/-721,-635/-630)。我们通过定点诱变和染色质免疫沉淀的方法证实雌激素通过其受体ERα与BMP-6启动子上1/2 ERE元件和Sp1位点的结合来激活BMP-6 mRNA表达水平。在本部分实验中,我们还发现雌激素不能调控ER-乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的BMP-6水平,即使在该细胞中过量表达ERα,也不能改变这种现象,推测表观遗传学修饰参与调控乳腺癌中的BMP-6表达。
本文第二部分实验着重于研究甲基化修饰参与调控乳腺癌细胞中BMP-6表达的现象。通过对BMP-6启动子区域DNA序列的分析,发现在BMP-6的-1000～-120bp区域是富含CpG岛区域。ER+乳腺癌细胞系MCF-7、T47D和ER-乳腺癌细胞系MDA-MB-231中BMP-6表达水平存在明显差异。MDA-MB-231中的BMP-6表达水平仅为MCF-7、T47D的30％,而去甲基化试剂5-aza-2-deoxycytidine(5-aza-dC)的加入可使MDA-MB-231中的BMP-6表达水平明显升高。通过甲基化敏感限制性内切酶PCR(methylation-sensitive enzymerestriction PCR,MSRE-PCR)和亚硫酸盐处理测序(bisulfite sequencing,BSG),我们发现与MDA-MB-231相比较,MCF-7、T47D的BMP-6启动子处于去甲基化状态。此外,我们通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)对33例乳腺癌病例进行检测,在16例雌激素受体阴性的乳腺癌中发现BMP-6启动子均处于甲基化状态,而在17例雌激素受体阳性的乳腺癌中有14例BMP-6启动子处于去甲基化状态,我们推测BMP-6启动子的甲基化状态与乳腺癌的雌激素受体状态相关。乳腺癌的发生和骨转移的分子机制十分复杂,雌激素和BMP-6在其过程中的具体功能尚不明晰。本文旨在探讨BMP-6在ER+乳腺癌细胞中的表达调控的分子机制,为进一步确定BMP-6在ER+的乳腺癌发生和骨转移过程中发挥的作用提供实验依据。
第二部分:Cyclin D1通过诱导Runx3的磷酸化和泛素化介导其降解并调控其生物学活性。软骨内成骨是脊椎骨形成的主要途径。软骨细胞经历增殖型软骨细胞、前肥大型软骨细胞、肥大型软骨细胞几个阶段,最终凋亡矿化。软骨细胞增殖和分化的过程受多种因子的严格调控,如细胞周期蛋白、转录因子Runx2/3和PTHrP信号通路。
Runx3基因是Runt结构域转录因子家族成员,在调控胃上皮细胞生长、背轴神经中枢的神经发生、CD8系T细胞分化过程中起着关键性作用。以前对Runx3的研究局限于它作为抑癌基因在肿瘤发生过程中的作用,而近期研究发现Runx3对于正常的软骨发育过程同样十分重要。与runx2敲除小鼠相比,runx2/3双敲除小鼠表现出更彻底的软骨细胞终极分化停滞现象,说明Runx3同样是软骨细胞成熟过程所需的。在软骨细胞成熟的过程中,Runx3局限在增殖型/前肥大型软骨细胞中表达,促进软骨细胞分化,其表达水平与细胞周期蛋白活性密切相关。
细胞周期蛋白在调控软骨细胞增殖和分化过程中同样发挥着重要的作用。与野生型小鼠相比,cyclin D1敲除小鼠表现其生长板处增殖型软骨细胞区域明显缩小。Cyclin D/CDK4/CDK6激酶复合物通过磷酸化Rb使E2F恢复其转录激活活性,激活一系列下游基因的表达,从而促使细胞通过G1/S检验点。而决定细胞是否通过G1/S检验点对于决定细胞是维持增殖状态还是停止增殖进入分化状态十分关键。此外,cyclin D蛋白还参与调控多种与软骨细胞增殖和分化相关的转录因子的表达,如myb样转录因子DMP1、Smad蛋白和Runx2。
泛素-蛋白酶体降解途径是基因表达翻译后水平调控的重要形式之一。E3泛素连接酶通过特异性识别底物蛋白的PY基序(PPXY)介导泛素连接到底物蛋白的lysine残基上,从而被蛋白酶体识别并降解。Runx3蛋白上有两个潜在的诱导蛋白降解区段(degron)：可被细胞周期蛋白cyclin D识别并磷酸化的SP基序(356-359Aa,SPTR);被E3泛素连接酶识别并泛素化的PY基序(309-312Aa,PPPY)。
本实验旨在阐明细胞周期蛋白cyclin D1调控Runx3蛋白表达和Runx3活性的分子机制,主要验证以下两方面假设：
1)在G1/S检验点发挥作用的cyclin/CDK复合物cyclin D1/CDK4介导Runx3蛋白的磷酸化并诱导其通过泛素-蛋白酶体途径被降解；
2)Cyclin D1/CDK4抑制Runx3在骨前体细胞中的转录激活功能。
为了证实以上假设,我们在COS7细胞中过量表达Runx3和cyclin D1,通过Western blot和免疫共沉淀检测Runx3蛋白水平变化、磷酸化程度和泛素化程度。随后通过检测碱性磷酸酶活性(ALP)来检测cyelin D1对Runx3促进骨相关细胞分化能力的影响。本实验证实cyclin D1/CDK4复合物与Runx3蛋白直接结合并介导其磷酸化、泛素化,最终导致Runx3的降解,并确证了Runx3蛋白上的serine-356残基在该过程中的关键性作用。此外,我们也证实了Runx3在骨相关细胞中的转录激活活性受cyclin D1/CDK4复合物的抑制。
本实验所发现的这种细胞周期蛋白翻译后调控转录因子Runx3的模式为探讨协调软骨细胞增殖和分化这两个负相关的过程的具体分子机制提供了实验依据。