新型隐球菌性脑膜炎是因为遭受新型隐球菌感染导致的一种发生于中枢神经系统的严重感染。研究表明,隐球菌性脑膜炎存在机体免疫损伤,多存在巨噬细胞的功能异常及Th1型细胞免疫受抑,Th2型细胞免疫过度激活。而巨噬细胞的激活状态是机体抗感染的关键所在。新型隐球菌侵入机体后,巨噬细胞能参与机体原发性及适应性免疫应答,杀灭隐球菌,另一方面可吞噬隐球菌,作为机体扩散载体造成全身性感染。巨噬细胞具有动态的可塑性,其活化表型受不同的细胞因子控制。Th-1型细胞介导的免疫应答可以诱导淋巴细胞和巨噬细胞的募集和活化,产生抗隐球菌迟发型过敏反应,从而控制感染。而Th-2型细胞介导免疫应答和替代激活的巨噬细胞则会造成真菌的过度繁殖和病情恶化。共刺激分子是表达在免疫细胞和与免疫有关细胞上的一种特殊蛋白,此蛋白的介导信号即为共刺激信号。此信号能够双向调节机体免疫,人体免疫状态要想维持平衡需要共刺激信号中的正、负两种信号实施调节作用。当中程序性死亡因子1(Programmeddeath 1,PD-1)和配体是能够引起负性共刺激信号的分子,该分子对于机体免疫应答反应有抑制作用,有益于机体免疫系统的自行调节保持稳定状态。近年来研究表明巨噬细胞表面有PD-1:PD-L1/PD-L2分子的表达,提示共刺激分子对巨噬细胞的免疫调节作用对机体抗隐球菌感染有一定的影响。本研究旨在探讨PD-1/PD-L1信号通路对隐球菌性脑膜炎患者及小鼠模型小胶质细胞/巨噬细胞活化和T淋巴细胞亚群的影响,分析了罹患此类脑膜炎病症的126名患者在接受治疗(两性霉素B)前后、以及健康组外周血单个核细胞表面PD-1、PD-L1mRNA和蛋白表达情况,分析共刺激分子表达如果发生失调现象会对患者免疫功能造成何种影响。此外,本研究还开展体外实验构建了患鼠模型,对比正常组(Normal Control组,n=15)、隐球菌脑膜炎模型组(CM model组,n=15)、二性霉素B治疗组(CM+AmB组,n=15)、假手术组(Sham组,n=15)、PD-1抗体组(CM+PD-1 Ab组,n=15)。通过分析新型隐球菌性脑膜炎小鼠Th1及Th2型细胞因子的变化,小胶质细胞/巨噬细胞的吞噬功能变化,CD4+T、CD8+T两种不同细胞计数改变、巨噬细胞、小胶质细胞、CD4+T、CD8+T细胞PD-1/PD-L1表达的差异,为此类疾病的治疗和预防拓宽思路。第一部分PD-1/PD-L1信号通路对隐球菌性脑膜炎患者免疫功能的影响目的对罹患隐球菌性脑膜炎病患外周血PD-1/PD-L1细胞表达,讨论患者免疫功能系统与健康群体之间差异,以及此病变现象和共刺激分子之间的关系。方法(1)搜集了患者(126人)和健康者(126人)的外周血,运用qRT-PCR方法、Elisa方法对两组人员的PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白表达,找出其中差别;(2)对病患组采用两性霉素B进行治连续8周之后使用qRT-PCR及Elisa法分别检测PD-1、PD-L1 mRNA及蛋白的表达情况。结果(1)与对照组相比,隐球菌性脑膜炎组外周血中PD-1,PD-L1mRNA及蛋白表达量显著升高(P<0.001,P<0.001)。(2)与治疗前相比,治疗后隐球菌性脑膜炎组PD-1,PD-L1mRNA及蛋白表达量均显著降低(P<0.001,P<0.001)。结论病患组人员的外周血单个核细中PD-1,PD-L1表达存在明显异常,说明共刺激分子表达如果发生异常(失调)将对患者免疫功能造成影响,并且使用两性霉素B治疗一段时间之后,患者的共刺激分子表达失调现象将有效逆转。第二部分PD-1/PD-L1信号通路对隐球菌性脑膜炎小鼠模型脑组织小胶质细胞/巨噬细胞活化和T淋巴细胞亚群的影响目的观察隐球菌性脑膜炎小鼠模型脑组织病理变化、患鼠死亡率,比对研究实验患鼠Th1型、Th2型两类细胞因子发生的改变,巨噬细胞、小胶质细胞吞噬功能的改变,CD4+T、CD8+T两类细胞计数改变、巨噬细胞、小胶质细胞、CD4+T、CD8+T两类细胞的PD-1/PD-L1表达差别,讨论PD-1/PD-L1信号通路对患鼠巨噬细胞/小胶质细胞活化及其T淋巴细胞亚群可能造成的影响。方法(1)建立隐球菌性脑膜炎小鼠模型,分正常对照组(Normal Control组,n=15)、隐球菌脑膜炎模型组(CM model组,n=15)、二性霉素B治疗组(CM+AmB组,n=15)、假手术组(Sham组,n=15)、PD-1抗体组(CM+PD-1 Ab组,n=15)。(2)观察各组小鼠存活情况以及脑组织病理改变。(3)采用Elisa检测Th1细胞因子IFN-γ和TNF-α及趋化因子CXCL9和CXCL10及Th2细胞因子IL-6、IL-10表达水平。(4)采用振摇结合贴壁分离法分离纯化小胶质细胞,采用免疫磁珠分离CD4+T细胞、CD8+T细胞,检测小胶质细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞活力,计数CD4+T细胞、CD8+T细胞比例。(5)采用免疫组化检测小胶质细胞/巨噬细胞活化标志物Iba1蛋白的表达;采用免疫荧光法检测小胶质细胞/巨噬细胞吞噬体标志物Rab5及Rab11的表达情况。(6)采用qRT-PCR及蛋白印迹检测小胶质细胞/巨噬细胞、CD4+T、CD8+T细胞PD-1/PD-L1mRNA及蛋白表达水平。结果(1)正常对照组无小鼠死亡,隐球菌性脑膜炎模型组感染12天后,有7只小鼠死亡,相比于正常对照组,小鼠的死亡率显著升高(P=0.003),假手术组只有1只小鼠在手术过程中死亡,对比正常组没有显著差异(P=0.309)。与CM模型组相比,CM+AmB组及CM+PD-1 Ab组小鼠死亡只数分别为2、1,小鼠死亡率相比于CM模型组显著降低(P=0.046,P=0.0132)。(2)对比对照,CM model组患鼠脑组织出现炎症细胞以及软化坏死灶,脑膜血管明显充血,出现明显“套袖”现象(“套袖”现象见箭头所示),蛛网膜下腔扩张;与CM model组对比,CM+AmB组小鼠的脑组织中炎症细胞渗出现象明显好转,血管“套袖”问题也有所改善,没有明显的坏死软化灶出现,蛛网膜下腔变小;同时CM+PD-1 Ab组小鼠脑组织内较少发现炎症细胞,坏死软化灶、血管套袖以及蛛网膜下腔表现均与正常小鼠没有明显差异。(3)与对照组比,CM模型组小鼠脑组织中Th1细胞因子IFN-γ和TNF-α及趋化因子CXCL9和CXCL10水平降低、Th2细胞因子IL-6、IL-10水平升高。与CM模型组相比,CM+AmB组和CM+PD-1 Ab组脑脊液Th1细胞因子IFN-γ和TNF-α及趋化因子CXCL9和CXCL10水平升高、Th2细胞因子IL-6、IL-10水平降低。(4)纯化分离的小胶质细胞使用免疫细胞化学检测标志物CD68,结果显示培养的小胶质细胞纯度在95%以上。与正常对照相比,CM模型组CD4~+T纯度及细胞活力明显下降,CD8~+T纯度及细胞活力明显升高,CD4~+T/CD8~+T比值下降,小胶质细胞活力上升(均P<0.05)。假手术组对比正常相比并没有发现明显差异。与CM模型组相比,AmB治疗组CD4~+T纯度及细胞活力明显上升,CD8~+T纯度及细胞活力明显降低,CD4~+T/CD8~+T比值上升,小胶质细胞活力下降(均P<0.05)。PD-1Ab组与CM模型组相比差异更显著(均P<0.05),接近正常水平。(5)与对照组比,CM模型组Iba1蛋白表达量明显增高,与CM模型组相比,AmB及PD-1Ab组Iba1蛋白表达量明显减少,PD-1Ab组更显著。(6)与对照组比,早期吞噬体标志物Rab5及Rab11在CM模型组中表达量下降,而在AmB及PD-1Ab组中Rab5及Rab11较CM模型组明显上升,PD-1Ab组增加更显著。(7)与对照组比,CM模型组PD-1,PD-L1在CD4+T、CD8+T及小胶质细胞/巨噬细胞(M/M)中表达量均显著升高。与CM模型组相比,AmB及PD-1Ab组PD-1,PD-L1在CD4+T、CD8+T及小胶质细胞/巨噬细胞(M/M)中表达量均显著降低,其中PD-1Ab组更显著。结论1.在隐球菌性脑膜炎小鼠模型中,两性霉素B和PD-1抗体有助于降低小鼠的死亡率,改善脑组织结构。2.隐球菌性脑膜炎小鼠模型中存在Th1/Th2型细胞因子失衡,而使用两性霉素B或PD-1抗体可纠正该失衡。3.隐球菌性脑膜炎小鼠模型中存在小胶质细胞/巨噬细胞活化及吞噬功能的异常。4.隐球菌性脑膜炎小鼠模型中,CD4+T细胞的纯度和活力下降,CD4+/CD8+T细胞比例下降,而CD8+T细胞的纯度和活力增加,而使用PD-1抗体治疗可逆转该种情况。5.隐球菌性脑膜炎小鼠模型中,小胶质细胞/巨噬细胞及CD4+T、CD8+T细胞的共刺激分子表达异常,两性霉素B和PD-1抗体均可阻断PD-1/PD-L1信号通路和治疗隐球菌性脑膜炎,而其中PD-1抗体具有更显著的抑制作用。