研究背景与目的胰腺癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界因罹患恶性肿瘤致死的病例中,胰腺癌在死亡原因中排第四位。在我国,胰腺癌的发病率和死亡率也是逐年升高。胰腺癌是一种具有高度侵袭性的疾病,当其被确诊时常常已进展至晚期,预后不良。尽管在化疗和放疗领域已取得了显著的进展,但是很多胰腺癌患者的疗效仍然不佳,有的病例甚至产生了对化疗或放疗的抵抗。鉴于此,研究开发更为有效的胰腺癌治疗策略就显得尤为必要了。研究表明,芹菜素(4,5,7-三羟基黄酮)是一种在蔬菜和水果中普遍存在的膳食类黄酮化合物,同时也是一类具有潜在防癌作用的药剂,它对于胰腺癌的预防和治疗具有积极作用。很多研究表明,芹菜素抑制了多种恶性肿瘤的发生发展和血管新生,比如:芹菜素对恶性黑色素瘤、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌和结肠癌细胞均有抑制作用。芹菜素的这些作用主要是通过抑制环氧合酶-2(COX-2),基质金属蛋白酶9(MMP-9)、一氧化氮合酶(NOS-2层2)和脂肪氧合酶等来实现的,而这些酶都受到NF-κB的调节。因此我们推测,芹菜素是通过调控NF-κB的活化,来对胰腺癌细胞的生长发挥抑制作用的。NF-κB是一个转录因子家族,与其抑制分子IκB家族相结合处于非活化状态,存在于细胞质中。当各种刺激(比如:炎症细胞因子、细菌或病毒产物、各种类型的应激等)作用于细胞时,IκB分子就会在两个关键的丝氨酸残基位点发生磷酸化,继而发生聚泛素化并被蛋白酶体降解。与IκB解离后的游离NF-κB从细胞质中转移入细胞核内,激活了相应靶基因的转录。NF-κB调控的靶基因多种多样,涉及到了免疫及炎症反应、细胞粘附、生长调控、抗凋亡等作用范围。我们的研究目的:因为前人的研究表明转录因子NF-κB在胰腺癌中发挥了至关重要的作用,所以在研究芹菜素抑制胰腺癌细胞生长的作用机制时,我们仍选取了NF-κB作为主要研究对象并试图弄清它所扮演的角色。我们希望阐明芹菜素是如何调控NF-κB活化,进而抑制胰腺癌细胞的生长。材料与方法1、芹菜素与细胞系芹菜素购买自sigma-aldrich(st.louis,mo),加入细胞培养基前先溶解于二甲基亚砜(dmso)中。人胰腺癌细胞系购买自美国模式培养物收藏库(americantypeculturecollection,atcc),所有细胞系均培养在含有5%co2、恒温37℃的细胞培养箱中,培养基采用加入了10%胎牛血清的rpmi-1640培养基。2、细胞生长测定采用mtt法测定细胞的生长情况。细胞加入1mg/ml的mtt孵育3小时,随后溶解于dmso中。在酶联免疫检测仪上测定各个样本的吸光度(absorbance,a),计算出相对应的细胞存活率。3、细胞凋亡检测细胞凋亡采用流式细胞术进行检测。细胞先用芹菜素处理,然后用膜联蛋白v和碘化丙啶(annexinv/pi)染色,染色步骤按照annexinv/pi检测试剂盒的说明书进行规范操作。染色完成后,将标本用流式细胞仪进行检测。4、半胱天冬酶-3(caspase-3)活性测定按照caspase-3活性检测试剂盒的操作说明,使用酶联免疫检测仪对细胞裂解物中caspase-3的活性进行检测。5、转染与荧光素酶检测使用脂质体2000(invitrogen,carlsbad,ca)进行瞬时转染,采用双荧光素酶报告分析系统检测荧光素酶活性。6、western蛋白质印迹实验收集处理完成的细胞,测定蛋白浓度,使每个样品上样的总蛋白量相同。使用10%sds-page凝胶电泳分离蛋白,随后再将蛋白转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜上。选择β-actin抗体作为内参抗体以判断各样品的上样量是否一致。7、电泳迁移率变动试验为了确定nf-κb的活化情况,用提取的细胞核蛋白进行电泳迁移率变动试验,nf-κb的dna共有序列购买自santacruzbiotechnology。使用100倍未标记的dna进行竞争实验来评价结合的特异性。针对p65和p50的抗体被用来进行超级迁移率变动试验。dna与蛋白质的复合物存在于4%聚丙烯酰胺凝胶上,通过放射自显影进行观察分析。8、体外ikk-β激酶活性测定与腺病毒感染使用htscanikk-β激酶检测试剂盒(cellsignalingtechnology)测定ikk-β激酶的活性。为了使ikk-β过表达,我们使用β-半乳糖苷酶或野生型ikk-β腺病毒感染细胞,经过预实验后设定感染复数(moi)为50,感染时间为24小时,感染效率可达到80%~90%左右。9、裸鼠移植瘤模型体内实验使用4周大的balb/c雌性裸鼠作为实验对象,将aspc-1胰腺癌细胞(大约5×106个)注射入裸鼠皮下以形成异种移植瘤。裸鼠被随机分为3组(每组6只):对照组、芹菜素1组(15mg/kg)和芹菜素2组(30mg/kg)。芹菜素溶解于0.2ml含有0.5%甲基纤维素和0.025%吐温20的溶剂中。在长出可触及的肿瘤(体积大约50-100mm3)后,芹菜素1组和2组的裸鼠按照设定的用药量每天灌胃,直至满6周为止。对照组仅接受0.2ml的单纯溶剂(含有0.5%甲基纤维素和0.025%吐温20)灌胃。肿瘤的大小每周测两次,并通过公式:体积=宽度2×长度/2,计算每只裸鼠的成瘤体积。6周后将裸鼠处死,并取出相应的肿瘤标本进行后续的western蛋白质印迹实验。10、统计学分析实验所得数据的统计学分析采用spss软件完成。计量资料使用“平均数±标准差”表示。使用双侧studentt检验判断各组间是否有统计学意义上的显著性差异,显著性水准为:p<0.05或p<0.01。结果1、芹菜素以一种浓度依赖的模式抑制了胰腺癌细胞的生长,aspc-1、panc-1和miapaca-2三种胰腺癌细胞的半数抑制浓度(ic50值)分别为:28.5um、46.8um和60.7um。此外,芹菜素诱导胰腺癌细胞发生了凋亡,而不是发生坏死。在胰腺癌细胞中,芹菜素以一种浓度依赖的模式诱导了caspase-3的活化,并且导致了parp发生剪切。2、使用浓度为10ng/ml的tnf-ɑ预处理aspc-1胰腺癌细胞3小时,用emsa检测发现nf-κb的dna结合活性明显升高,然而,将aspc-1胰腺癌细胞用浓度为40um的芹菜素预培养6小时,可以明显抑制tnf-ɑ诱导的nf-κb的dna结合活性。此外,芹菜素预培养也降低了aspc-1胰腺癌细胞中nf-κb基础状态的dna结合活性。3、芹菜素既能降低aspc-1胰腺癌细胞基础状态时nf-κb的转录活性,又能降低tnf-ɑ诱导后nf-κb的转录活性。浓度为10ng/ml的tnf-ɑ即可刺激aspc-1胰腺癌细胞中p65和p50的核易位,然而使用浓度为40u M的芹菜素预培养可以显著地预防这一过程的发生。在用TNF-ɑ处理过3小时的As PC-1胰腺癌细胞中,使用芹菜素可以显著地抑制IκB-ɑ的降解和磷酸化。此外,芹菜素也能略微地减少细胞内基础水平的p65和p50核易位以及IκB-ɑ降解。4、使用浓度为40u M的芹菜素预培养6小时,可以适度地抑制TNF-ɑ诱导的IKK-β表达,但是却没有改变IKK-ɑ的表达水平。芹菜素也能显著地降低IKK-β的磷酸化水平和IKK-β激酶活性。5、IKK的抑制剂Bay 11-7082能够增强芹菜素对AsPC-1胰腺癌细胞的生长抑制作用。此外,联用芹菜素和Bay 11-7082处理细胞24小时还能增加PARP的剪切。这些结果均提示:抑制或阻断IKK能够有效地增强芹菜素对胰腺癌的抗癌功效。6、IKK-β过表达显著地减弱了芹菜素对胰腺癌细胞的生长抑制作用,这从另一个角度提示:抑制IKK-β的活化将有助于芹菜素发挥对胰腺癌细胞的生长抑制作用。7、在裸鼠移植瘤模型体内实验中发现,使用30mg/kg剂量的芹菜素可以有效缩小肿瘤的体积,该作用从用药4周时开始持续至用药6周终止时。在此过程中,所有接受芹菜素治疗的裸鼠均未出现任何中毒的征象。另一方面,与对照组相比,芹菜素组还能明显减少IKK-β的表达和活化,进一步证实了体外实验的数据。对于细胞凋亡作用方面,使用Western蛋白质印迹实验研究发现,芹菜素组增加了PARP和caspase-3的剪切,这证明芹菜素对裸鼠移植瘤模型的治疗作用,至少部分是通过诱导凋亡来实现的。结论:我们研究发现:芹菜素抑制了胰腺癌细胞生长,诱导了细胞凋亡;在NF-κB的DNA结合活性和转录活性方面,芹菜素既能降低NF-κB的基础活性,又能降低TNF-ɑ诱导后的NF-κB活性;芹菜素也能抑制IκB-ɑ的磷酸化以及p65和p50的核易位;芹菜素还能阻断IKK-β的活性。此外,IKK的阻断可以增强芹菜素的抗癌功效,相反,IKK-β的过表达会减弱芹菜素诱导的细胞生长抑制作用。在裸鼠的异种移植瘤模型中,我们使用30mg/Kg的芹菜素即可抑制胰腺癌的生长与IKK-β的活化。以上结果表明:芹菜素能够负向调控IKK-β介导的NF-κB活化,进而抑制胰腺癌细胞生长,它在胰腺癌治疗领域具有潜在的应用前景。