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耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans,Dr）是迄今为止发现的对电离辐射、紫外线、干燥、化学诱变剂和其它一些DNA损伤因子耐受性最强的一类细菌。这种极端抗性被认为是由于D.radiodurans具有一套高效DNA损伤修复系统。在DNA损伤方面,5000 Gyγ射线可以在D.radiodurans每个基因组中产生大约200多个断裂的DNA双链片段（DNA double-strand breaks,DSBs）,大于3000个断裂的DNA单链片段（DNA single-strand breaks,SSBs）和超过1000个碱基损伤位点。在这些DNA损伤当中, DNA双链断裂对于细胞的生存是最致命的。D.radiodurans可在数小时内把这些DNA损伤全部修复,精确重建基因组并保持活力和性状的稳定。近年来的研究结果显示,D.radiodurans的辐射抗性源于其高效的DNA修复能力,同时电离辐射和紫外辐射产生大量的氧自由基,可间接造成DNA损伤。因此,D.radiodurans超强的辐射抗性可能与其抗氧化能力密切相关。D. radiodurans在长期的进化过程中形成的氧化防御体系,包括酶类和非酶类。它们能清除氧自由基,参与抗氧化系统的调控,有效防止自由基所致的DNA损伤,表现出超强抗氧化和耐辐射能力。对D.radiodurans极端抗性和DNA损伤修复机制的研究,将有利于更好的研究肿瘤细胞的发病机制和寻找抗辐射药物,并可将其用于辐射污染环境的修复。RecFOR途径是D.radiodurans同源重组特有的修复途径。到目前为止,D.radiodurans RecFOR分子调控机制还未阐明。本研究拟选择参与D.radiodurans重组修复RecFOR途径的两个关键基因recO和recF,分别构建D.radiodurans RecO和RecF原核和真核表达体系,观察目的基因在宿主受到紫外辐射时的防护效应,为后续紫外生物防护的研究提供实验依据。一、耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans,Dr）RecO和RecF原核表达体系的建立1.根据GenBank收录的D.radiodurans（Dr）基因序列recO（DR0819）和recF（DR1089）编码区,应用Primer5.0分别设计特异性引物,以D.radiodurans基因组为模板,PCR扩增recO和recF全长基因。将得到的PCR片段T-A克隆于pGEM-T载体,测序验证。2.将测序验证的recO和recF连接于表达载体pET30b（+）,转化构建的原核表达重组质粒pET30b（+）-recO和pET30b（+）-recF至E.coli BL21（DE3）。3.优化RecF、RecO蛋白诱导条件:选择不同的IPTG浓度、不同的诱导时间及温度对蛋白表达量的影响,确定蛋白诱导的最佳条件。研究表明,IPTG浓度为0.3 mM,16℃诱导过夜,RecF融合蛋白表达量最高;IPTG浓度为0.1 mM,37℃诱导23 h,RecO融合蛋白表达量最高。4.接受UVC辐照后E.coli pET30b（+）-recO、E.coli pET30b（+）-recF、E.coli BL21（DE3）和E.coli pET30b（+）的生存率都受到抑制,从接受50 J/cm2 UVC辐照开始E.coli pET30b（+）-recF的生存率明显高于其它三株菌;E.coli pET30b（+）-recO能耐受UVC的辐照剂量显著低于E.coli pET30b（+）-recF,但明显高于另外两株菌。RecF的保护作用强于RecO。二、转染recO或recF基因的人皮肤成纤维细胞抗UVB损伤效应的研究1.建立转染人皮肤成纤维细胞模型:采用胰酶消化法体外分离和培养人皮肤成纤维细胞（HSF）。在细胞分离后第3天,消化细胞传代,HE染色观察成纤维细胞的纯度。染色后镜下可见细胞边缘清晰,包体呈梭状或多角形,核仁清晰,胞核凸起明显。通过测定生长曲线,确定分离后4～7天为其对数生长期,此阶段细胞生长活跃,繁殖旺盛,适合后续辐照实验对细胞数量的要求。用脂质体法将构建的pcDNA3.1-NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3.1-NT-GFP Fusion TOPO-recF重组质粒转染至体外培养HSF,通过MTT检测未转染HSF增殖活性变化确定0、30、90、120 mJ/cm2 UVB为实验剂量。2.MTT法测定细胞生长曲线:共设4个实验组（转染recO未辐照组、转染recO辐照组、转染recF未辐照组、转染recF辐照组）和3个对照组（未转染未辐照组、未转染辐照组、转染空质粒辐照组）开展MTT实验,结果显示:未转染未辐照组、转染recO未辐照组、转染recF未辐照组生长曲线无显著性差异。转染recO辐照组和转染recF辐照组细胞增殖活性在接受90 mJ/cm2 UVB辐照后第4天开始恢复,与未转染未辐照组和转染空质粒辐照组有显著性差异（P<0.05）。尽管接受90 mJ/cm2 UVB辐照后转染recO辐照组和转染recF辐照组细胞增殖活性能在一定程度上恢复,相较于未受辐照的细胞来说被辐照细胞的增殖活性受到强烈抑制。3.RecF和RecO转染组辐照损伤形态学比较:未转染HSF接受不同剂量UVB辐照后24 h,细胞表现出不同程度的损伤,以120 mJ/cm2 UVB损伤作用最为强烈。HSF经UVB照射30 mJ/cm2后,细胞逐渐变圆,肿胀,细胞出现空泡;照射剂量增加至90 mJ/cm2后细胞碎片和死亡细胞急剧增加。此外,在同一中等UVB辐照剂量下（≧ 90 mJ/cm2）,随培养时间的延长,细胞受损程度加重,具有明显时效关系。未转染未辐照组及转染recO未辐照组和转染recF未辐照组细胞形态无异。90 mJ/cm2 UVB辐照后转染recO辐照组和转染recF辐照组细胞形态开始发生变化,以最初的梭形或多角形变为不规则形状,胞浆中空泡化明显,胞间的缝隙增大,但未见明显的细胞碎片和死亡细胞。该结果提示转染recO或转染recF能在一定程度上减缓由UVB辐照引发的HSF凋亡。5.细胞抗损伤能力检测:培养液中LDH可作为反映细胞早期损伤比较敏感的指标之一,存在于细胞浆中。当离体培养的细胞受到某些因素刺激时,细胞膜通透性发生改变LDH可以从细胞中漏出。用选定UVB剂量辐照HSF后在24 h、48 h、72 h三个时相点检测培养液中LDH浓度。UVB在低剂量时,对未转染组细胞即有损伤作用,引起LDH向细胞外渗透,高剂量时更为明显。转染recO和recF组LDH含量与未转染组和转染空质粒组相比在UVB照射后24 h无明显差异（P>0.05）,在照射后48～72 h转染空质粒组与转染recF组（P<0.01）和转染recO组（P<0.05）LDH有显著性差异。6.细胞抗氧化能力检测:SOD活力高低可间接反映细胞清除氧自由基的能力,MDA是脂质过氧化物的产物,其含量的高低间接反映了细胞脂质过氧化程度和细胞受自由基攻击后的损伤程度。体外分离培养HSF在接受30 mJ/cm2 UVB辐照后,细胞存活率和T-SOD的活力呈剂量依赖性的下降,而LDH和MDA的含量呈剂量依赖性升高。辐照后24～72 h,转染recO和recF都能在一定程度上缓解了UVB引起的细胞T-SOD下降,MDA升高,增殖活力下降,提高了HSF细胞清除氧自由基的能力。7.细胞抗炎能力检测:在活体皮肤组织中,防御外界刺激主要依靠的人皮肤角化细胞（HKC）能接受外界刺激后开始激活细胞内的信号传递系统。HKC在受到紫外线刺激后开始分泌IL-1α,间接诱导包括HSF在内的多种细胞生成IL-6。TNF-α是诱发肿瘤和调控机体免疫反应的关键因子,与UVB辐射引起的皮肤损伤、炎症反应和细胞凋亡等密切相关。本实验中UVB对未转染组、转染空质粒组及转染recO和recF组细胞中IL-6和TNF-α分泌的结果表明UVB辐照能促进离体细胞IL-6及TNF-α的分泌增加,分泌量在一定范围内随照射剂量升高而呈上升趋势。转染recO和recF后HSF细胞IL-6分泌明显低于接受同等辐射剂量的未转染组和转染空质粒组。综上所述,本研究将D.radiadurans的recF和recO克隆于pET30b（+）表达载体,使其表达处于T7噬菌体强启动子转录和翻译的信号控制之下,IPTG诱导在宿主菌E.coli BL21（DE3）中高效表达,初步建立了recO和recF表达体系。体外实验初步验证了RecO和RecF能提高E.coli对紫外线的抵抗能力。用脂质体法将构建的pcDNA3.1-NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3.1-NT-GFP Fusion TOPO-recF重组质粒转染至体外培养的HSF,分别观察转染HSF抗UVB损伤的效应。结果提示:转染HSF中的recF和recO均能增强细胞对氧自由基的清除能力,抑制细胞脂质过氧化来缓解UVB对细胞造成的损伤,增加细胞对UVB损伤的抵抗能力。其中转染recF组细胞的生存率、抗氧化及抗损伤效应明显强于转染recO组细胞,其具体机制还有待进一步深入研究。目前国内外对D.radiodurans抗辐射效应的研究主要集中在电离辐射损伤。本研究通过构建D.radiodurans高效蛋白表达体系;转染recF与recO至人皮肤成纤维细胞,发现转染基因能增强细胞抗紫外辐射能力。目前国内外尚未见相关研究报道。如果在观察转染细胞对紫外辐射抗性变化时能从mRNA水平检测RecF和RecO在不同时相点表达量的变化及光产物（CPDs和6,4PPs）数量变化两方面来验证recF和recO的有效性将更有说服力。