蒜头果MEX基因的克隆及植物转化

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神经酸(Nervonic Acid, NA),又名鲨鱼酸(Selacholeic Acid),学名为:顺—15—二十四碳烯酸(cis-15-Tetracosenic Acid),是超长链脂肪酸的一种。神经酸是脑白质的组成部分之一,也是大脑发育、维持的必需营养物。神经酸在增强免疫功能、防治艾滋病、神经发育、降脂降糖、改善大脑、增强记忆以及预防心血管系统疾病中都能起到关键作用。目前已作为药用脂肪酸进行开发和利用。虽然神经酸对人体有巨大作用,但人体自身却很难合成神经酸,需要靠体外摄取。神经酸过去主要靠猎捕鲨鱼获得,如今由于捕鲨遭到国际社会禁反对,神经酸的来源面临危机;最有效的途径是从广泛种植的作物种中获取,才能够达到廉价,大量生产神经酸的目的。神经酸的合成过程中的主要限速酶是β-酮脂酰-辅酶A合酶(3-ketoacyl-CoA synthase, KCS),本研究根据编码β-酮脂酰-辅酶A合酶的KCS基因的高度保守性设计引物,以蒜头果(Malania oleifera Chun et Lee)总DNA为模板,克隆得到了蒜头果β-酮脂酰-辅酶A合酶基因,命名为MEX。并且构建了种子特异性表达载体pNapinMEX。采用浸花法转化野生型拟南芥(Col-0),并测定了T1代转基因拟南芥种子的脂肪酸组分;采用农杆菌侵染法,以子叶柄作为外植体,转化了高芥酸含量的甘蓝型油菜品系GX-272。以研究蒜头果MEX基因能否在甘蓝型油菜中得到表达,进而生产神经酸;所得结果如下:1.根据KCS基因在不同物种间的高度保守设计引物,首次克隆了蒜头果中指导p-酮脂酰-辅酶A合酶合成的MEX基因全长CDS序列。对其进行生物信息学分析发现,该氨基酸的功能活性位点与能够编码具有活性的p-酮脂酰-辅酶A合酶的银扇草(Lunaria annua)KCS基因相符。2.构建了种子特异性表达载体pNapinMEXo3.采取浸花法转化野生型拟南芥(Col-0),获得8株转基因植株。4.采用气相色谱法测定了T1代转基因拟南芥种子的脂肪酸组分。5.采取农杆菌侵染法,以子叶柄作为外植体,转化了高芥酸含量的甘蓝型油菜品系GX-272,获得6株转化子并最终获得1株稳定遗传转化子。
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