元蘑多糖活性部位分析及对60Co-γ辐射损伤的防护作用

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电离辐射通过诱导人体产生过量的ROS,攻击机体中的生命物质,如蛋白质、脂质和糖类,引发自由基链状反应,破坏机体内环境稳态。科学研究发现长期暴露在电离辐射环境下能够诱导人体产生各种疾病,如衰老、炎症、心脑血管疾病,甚至引发癌症,筛选出高效低毒的辐射防护剂成为科研工作者研究的热点。据研究报道多糖能够通过提升机体的抗氧化系统和免疫系统的活性,从而发挥辐射防护的作用。因此,本论文以食用菌为研究对象,通过在体外建立多重抗氧化模型,从8种食用菌中筛选出抗氧化活性最强的中性元蘑多糖(NTHSP)作为后续研究目标;采用响应面设计优化NTHSP提取工艺,并对其进行纯化和结构表征;系统的研究了NTHSP在体外和体内对辐射诱导氧化应激的防护功效并揭示其辐射防护作用机制。采用酸碱度不同的3种溶剂从产自中国不同地区具有代表性的8种食用菌中分离23种食用菌多糖,成分分析结果表明食用菌多糖样品中仅含有少量蛋白质,无多酚类物质;通过在体外建立抗氧化模型,研究了食用菌多糖对生理性OH·自由基、超氧自由基和非生理性ABTS自由基的清除活性、对脂质过氧化反应的抑制作用以及铁离子还原能力,结果表明NTHSP的抗氧化活性最强,选择其作为后续研究对象。采用响应面设计对NTHSP提取工艺进行优化,得到最佳提取条件为:提取温度94℃、提取时间3.0h、液料比110:1和超声功率480W,所得到的多糖提取得率为17.45±0.18%,而通过传统方法提取NTHSP的得率仅为10.21±0.36%;通过离子交换纤维素DEAE-52及葡聚糖凝胶层析Sephadex G-100对NTHSP进行纯化,采用凝胶渗透色谱(GPC)、气质联用(GC-MS)、红外光谱(FT-IR)、核磁共振光谱(NMR)和原子力显微镜(AFM)对其结构进行表征,结果表明NTHSP为一种具有高分支结构的葡聚糖,分子量为8.09×103,由阿拉伯糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖(3.8:15.8:28.4:10.5)组成,主链由→3,6)-α-D-Glcp-(1→组成,其侧链→2)-α-L-Arap-(1→、α-D-Manp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→分别连接在→3,6)-α-D-Glcp-(1→的3位、3位和6位上,其中,→2)-α-L-Arap-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→的2位和6位分别连接甲基。通过在体外建立辐射诱导细胞氧化损伤模型,研究NTHSP对大鼠外周血白细胞、大鼠脾细胞和人脐静脉内皮细胞ECV304的辐射防护作用,通过对辐射后大鼠脾细胞中SOD和CAT的活性以及MDA的水平进行研究,发现NTHSP能够显著提升辐射后大鼠脾细胞中抗氧化酶SOD和CAT的活性,并降低脾细胞脂质过氧化反应的发生;NTHSP还能够有效的降低外周血白细胞中异形淋巴细胞、带空泡分叶细胞和退行性变细胞的数量,提升正常白细胞的数量,对外周血白细胞起到有效的防护;通过DNA ladder研究NTHSP对辐射后脾细胞DNA的防护作用,结果表明NTHSP对电离辐射诱导脾细胞DNA凋亡起到显著的防护功效,并不同程度的促进了脾细胞和内皮细胞增殖,显著的提升辐射后脾细胞和内皮细胞的存活率。通过在体内建立辐射诱导小鼠氧化损伤模型,研究NTHSP的辐射防护途径,结果显示NTHSP能够有效的提升辐射后小鼠体内的抗氧化酶系(SOD、CAT和GSH-Px)的活性和增强抗氧化物质(GSH、VE和铜蓝蛋白)的合成能力,并降低小鼠体内脂质过氧化产物MDA的水平,表明NTHSP能够增强辐射后小鼠抗氧化系统的活性;对辐射后小鼠特异性免疫和非特异性免疫进行研究,发现NTHSP能够有效的提升小鼠血液系统免疫能力、增加小鼠免疫器官指数、促进脾淋巴细胞增殖并增强单核细胞的吞噬作用;通过对小鼠骨髓微核、骨髓染色体畸变和DNA含量进行分析,结果显示NTHSP能够对辐射诱导小鼠产生的遗传毒性起到有效的防护。通过免疫组织化学方法和流式细胞仪检测脾细胞周期研究NTHSP的辐射防护机制进行研究,结果发现NTHSP能够有效的抑制电离辐射诱导小鼠脾细胞停滞在G0/G1期,并对电离辐射诱导的脾细胞凋亡起到防护功效,从而恢复细胞的正常生理代谢过程;通过对细胞凋亡线粒体途径相关蛋白表达进行分析,研究发现NTHSP能够通过抑制促凋亡蛋白Bax、细胞色素c和Caspase-3活化亚基的表达,促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达而抑制细胞凋亡,从而对辐射诱导氧化损伤具有防护功效。本课题研究发现NTHSP可以降低电离辐射诱导活性氧ROS的产生,调节细胞内氧化还原状态,提升机体免疫活性,通过影响线粒体凋亡信号途径相关蛋白表达而抑制细胞凋亡,从而对辐射诱导的氧化损伤具有显著的防护功效。另外,关于NTHSP对辐射诱导小鼠脾细胞凋亡的其他凋亡途径的影响还需进一步研究和探索。本研究对于揭示电离辐射防护途径具有一定的理论价值,对进一步开发天然高效辐射防护剂具有现实意义。
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