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目的本研究旨在通过建立耐氨甲蝶呤（MTX）对映体的A549细胞株并观察耐药细胞的生物学特征，应用液相芯片技术比较MTX对映体耐药细胞与亲本细胞中磷酸化蛋白表达谱，以期发现MTX耐药机制相关磷酸化蛋白标志物并了解该家族成员与MTX耐药的相关性，为临床选择有针对性的化疗药物和治疗方案提供依据。方法①采用浓度递增结合低剂量持续诱导，获得耐受25μmol/L MTX对映体的细胞系,分别命名为L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549；②倒置相差显微镜观察细胞形态变化；③细胞计数法绘制细胞生长曲线④MTT方法检测D-(-)-MTX/A549和L-(+)-MTX/A549细胞的耐药指数；⑤通过平板划痕实验反映D-(-)-MTX/A549和L-(+)-MTX/A549细胞移动能力；⑥采用双层软琼脂克隆形成实验检测D-(-)-MTX/A549组、L-(+)-MTX/A549组细胞的克隆形成率和集落形成的大小；⑦采用Luminex液相芯片技术检测三组细胞中7种磷酸化RTKs：磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)、磷酸化胰岛素样生长因子1受体(p-IGF-1R)、磷酸化肝细胞生长因子受体(p-HGFR）、磷酸化血小板源生长因子受体（p-PDGFRβ）、磷酸化人类表皮生长因子受体2(p-HER-2)、磷酸化血管内皮生长因子受体2(p-VEGFR2)、磷酸化血管生成素受体2(p-Tie-2)的表达水平，分析它们之间的相关性。结果①采用浓度递增结合低剂量持续诱导的方法，成功建立MTX不同对映体对A549细胞的耐药细胞株，L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549耐药指数分别为6.10的和20.64。②倒置相差显微镜观察耐药细胞株形态发生了改变；③细胞生长曲线显示D-(-)-MTX/A549的增值略慢于亲本细胞，而L-(+)-MTX/A549的增值最慢；④72小时后L-(+)-MTX/A549细胞进入划痕区的数量少于D-(-)-MTX/A549细胞；⑤软琼脂实验发现D-(-)-MTX/A549组、L-(+)-MTX/A549组以及亲本细胞组细胞的集落数以及形成率无明显差异（P>0.05），而D-(-)-MTX/A549组细胞的集落形状大小明显大于L-(+)-MTX/A549细胞；⑥D-(-)-MTX/A549组p-EGFR、p-HER-2、p-IGF-1R、p-HGFR、p-PDGFRβ、p-Tie-2、p-VEGFR-2的MFI分别为26.91±1.81、16.56±1.15、6.69±0.57、25.94±2.02、11.66±1.14、68.75±3.76、和16.94±1.84；L-(+)-MTX/A549组的MFI分别为54.13±2.75、16.94±1.44、6.56±0.54、26.06±2.52、12.06±1.61、70.88±3.78和16.75±1.48；亲本细胞组的MFI分别为54.38±2.88、33.75±2.49、6.47±0.59、28.25±2.64、11.56±1.55、72.44±4.03和17.00±1.67。磷酸化RTKs之间相关性：p-EGFR与p-HER-2相关关系显著(r=0.732,P<0.05)，p-HER-2和p-VEGFR、p-HGFR相关关系显著(r≥0.634,P<0.05)，其他磷酸化RTKs之间相关关系不显著。结论D-(-)-MTX诱导的非小细胞肺癌A549耐药细胞在体外运动、增殖能力均大于L-(+)-MTX耐药细胞，从而说明MTX对映体耐药细胞后细胞的转移力有差异；MTX对映体诱导的耐药细胞株中p-EGFR表达水平存在手性差异。