论文部分内容阅读
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2菌株能有效的防治棉花黄萎病,明确其生防作用机理将有助于提高其生防效果。本研究对影响B. subtilis NCD-2菌株遗传转化的因素进行摸索并对其转化条件进行优化,建立了该菌株的高效电击转化体系。通过比较5个不同大小和携带不同来源复制子的质粒对其转化效率的影响,发现质粒大小与NCD-2菌株的电击转化效率之间没有明确的相关性;而携带来源于B. coagulans复制子的质粒pNW33N时,NCD-2菌株的电击转化效率最高,可以达到3.6×104 cfu·μg-1 DNA,说明复制子来源是影响转化效率的一个重要因素。采用pNW33N质粒在不同电阻、电场强度及培养时间下的电击转化效率的研究结果表明,该菌株转接到生长培养基后,37℃、150 r·min-1培养3.5 h,在电阻值200Ω、电场强度14.0 kV·cm-1的条件下转化效率最高,能够达到6.1×104 cfu·μg-1 DNA。优化后的转化体系为顺利开展B. subtilis NCD-2菌株的分子遗传学研究奠定了基础。细菌的群体感应系统（quorum sensing,QS）是细菌根据特定的信号分子浓度监测环境变化,并调控相关基因表达来适应环境变化的一种现象。在枯草芽孢杆菌中,QS系统调控细菌生物膜的形成,抗生素的产成及芽孢的形成等性状。QS系统包括4个基因,即comX、comQ、comP和comA,其中ComX为10氨基酸肽,经ComQ修饰后分泌到胞外与膜上的组氨酸激酶ComP结合,ComP自磷酸化并将磷酸转移到ComA,磷酸化的ComA控制感受态形成等的一系列编码因子的转录。通过对B. subtilis NCD-2菌株进行全基因组序列分析,从中定位并克隆了QS系统基因comX、comQ、comP和comA。利用同源重组技术对B. subtilis NCD-2菌株中的comQ基因进行了定位突变,获得comQ基因缺失突变体菌株M6。提取B. subtilis NCD-2野生型菌株和突变体菌株M6的脂肽提取物。平板拮抗测定结果表明突变体菌株M6的脂肽提取物对番茄灰霉病菌的抑菌效果显著降低。将脂肽提取物通过基质辅助激光解析质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定分析表明:突变体菌株M6较NCD-2野生型菌株脂肽类物质FengycinB的产生量显著降低;M6比NCD-2多产生一种脂肽类物质IturinB。因此,推测comQ对FengycinB的产生具有正调控作用,对IturinB的产生具有负调控作用。质谱测定同时发现在NCD-2野生型菌株和突变体菌株M6脂肽提取物中均含有一类分子量较大的未知物质,但其在NCD-2野生型菌株中的浓度显著高于突变体菌株M6。说明comQ基因对于这组物质的产生有着重要影响。对NCD-2野生型菌株和突变体菌株M6生物膜的形成进行了定性检测和定量检测,结果表明突变体菌株M6的生物膜形成能力明显下降,推测群体感应系统comQ基因对生物膜的形成具有正调控作用。本研究为深入了解群体感应系统在NCD-2菌株生防中的功能提供了前提依据,为明确NCD-2菌株的生防机理提供了依据。