经转化生长因子-α刺激的骨髓间充质干细胞治疗急性放射性肠损伤的实验研究

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第一部分:SD大鼠BMSCs的分离、培养、纯化及其生物学特性鉴定的研究目的:体外分离、培养、纯化及鉴定SD大鼠BMSCs,以获得纯度高、生物学特征稳定的BMSCs,为课题研究奠定基础。方法:1运用密度梯度离心法联合细胞贴壁法从雄性SD大鼠股骨及胫骨中分离、培养和纯化BMSCs,并观察细胞形态。2流式细胞仪检测CD34、CD44和CD90的表达。3用冯库萨染色法(Von Kossa)染色法、油红O染色鉴定BMSCs向成骨、成脂肪细胞分化潜能。结果:1运用密度梯度离心法联合细胞贴壁法分离培养的BMSCs呈克隆式生长,梭形,大小均一。P3代BMSCs纯度达98.5%以上。2培养的BMSCs经流式细胞仪检测表达CD44、CD90表面抗原,不表达CD34表面抗原。3培养的BMSCs经成骨、成脂诱导培养后可向成骨细胞及成脂肪细胞分化。结论:密度梯度离心法联合细胞贴壁法能成功分离培养出SD大鼠BMSCs。且形态均一、增殖能力强、纯度高、生物学特征稳定,可用于本课题对BMSCs的实验研究。第二部分:TGF-诱导BMSCs向上皮细胞分化的研究目的:探究经TGF-诱导的BMSCs向上皮细胞的分化能力及最适诱导浓度,为下一步经TGF-刺激的BMSCs对放射性肠道损伤的实验研究奠定基础。方法:将培养在3板12孔细胞培养皿中的BMSCs每板随机分为四组,A组:空白对照组。B组:加入200ng/ml TGF-。C组:加入250ng/ml TGF-。D组:加入300ng/ml TGF-。用ELISA检测第1、3、7天各组细胞培养液的VEGF浓度,用免疫荧光法检测第1、3、7天BMSCs中CK蛋白。结果:1、四组培养液中均检测到VEGF,同期下C组浓度最高,P〈0.05。2、经TGF-刺激的BMSCs在培养7天后能检测CK蛋白,同期下C组阳性率最高,P〈0.05。结论:1、BMSCs在培养中能分泌VEGF2、TGF-能促进BMSCs分泌VEGF,在250ng/ml刺激下分泌较多3、TGF-能诱导BMSCs向上皮细胞分化,且250ng/ml的浓度诱导分化最明显。第三部分:经TGF-刺激的BMSCs干细胞对急性放射性肠道损伤的实验研究目的:1、建立急性放射性肠损伤大鼠模型;2、观察大鼠BMSCs及经TGF-刺激的BMSCs对急性放射性肠道损伤的治疗疗效,并初步探讨疗效机制。方法:1急性放射性肠损伤大鼠模型的建立: SD大鼠在我院放疗科用直线加速器进行X线照射。总剂量12Gy。2造模后的180只雌性SD大鼠随机分为3组(各60只),即A组(空白对照组)、B组(BMSCs治疗组)与C组(经TGF-刺激的BMSCs治疗组)。A组于照射后4小时内尾静脉输注1ml的生理盐水;B组于照射后4小时内尾静脉输注1×106/ml的SD大鼠BMSCs悬液1ml;C组于照射后4小时内尾静脉输注1×106/ml的经250ng/mlTGF-刺激的SD大鼠BMSCs悬液1ml。照射后第1天、3天、7天、14天、21天每组随机处死6只大鼠,留取全血与两份末端回肠标本。光镜下观察肠道组织结构,观察绒毛高度及隐窝深度;用ELISA方法检测血清及回肠组织中瓜氨酸及IL-6、TNF-、VEGF的浓度。结果:1SD大鼠急性放射性肠损伤模型建立:成功的建立了SD大鼠急性放射性肠损伤模型。2BMSCs及经TGF-刺激的BMSCs对急性放射性肠道损伤治疗效果:(1):与同时期A组相比较,B、C组SD大鼠回肠粘膜上皮细胞坏死和炎性细胞浸润少,绒毛及腺体数量较多;绒毛高度及隐窝深度C﹥B﹥A,P﹤0.05。(2):与同时期A组相比较,B、C组IL-6、TNF-在第3、7、14天浓度低,P﹤0.05,且C组浓度低于B组,P﹤0.05,第1天、21天无明显差异,P﹥0.05。(3):与同时期A组相比较,B、C组VEGF、瓜氨酸在第3、7、14天浓度低,P﹤0.05。且C组浓度高于B组,P﹤0.05,第1天、21天无明显差异,P﹥0.05。(4):组织瓜氨酸及IL-6、TNF-及VEGF浓度均高于同时期血清浓度。结论:1用直线加速器在总剂量12Gy下能成功建立急性放射性肠损伤动物模型。2BMSCs及经TGF-刺激的BMSCs均能促进急性放射肠损伤后肠道结构及功能的修复。3BMSCs及经TGF-刺激的BMSCs对急性放射性肠道损伤的修复均与抗炎、促增殖有关。4与单纯BMSCs比较,经TGF-刺激的BMSCs更显著地促进急性放射肠损伤后肠道功能的修复。
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