阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种发生在中枢神经系统中的慢性、原发性、且不可逆性的神经退行性疾病，其主要表现为进行性认知功能障碍、学习和记忆能力丧失，晚期出现严重的痴呆[1]。据报道有四种基因与其发生有关,包括：淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)[2,3]、早老素-1(presenilin-1, PS-1)[4]、早老素-2(presenilin-2, PS-2)[5,6]和载脂蛋白E4(apolipoprotein-E4, APOE4)[7,8]。其中，APOE4是迟发型家族性AD(late-onsetFamily Alzheimer’s disease)的主要危险因子。据统计，单个APOE4基因携带者AD的发病率是未携带该基因者的3.6倍，APOE4基因纯合子(apoE4+/+)携带者的AD发病率可达到未携带者的8倍[7,9]。APOE4基因过表达后的产物载脂蛋白E4（apolipoprotein E4, apoE4）已被证明具有较强的神经毒性。例如，apoE4可以加速淀粉样β蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)生成和沉积[10,11]，易化tau蛋白的高度磷酸化[12,13]，抑制延迟整流钾通道(delayed-rectifier potassium channels)的活性[14]，并且可以减少树突棘的密度[15]、树突的复杂性和大脑的代谢[16-18]。在细胞培养和人apoE4转基因小鼠(human apoE4target replacement mice)的实验中发现apoE4还可以引起炎症反应[19-23]。另外，过表达的apoE4可以损伤小鼠的空间记忆和逃避记忆[24-27]。然而，在体外apoE4过表达及缺失的小鼠脑片实验中，apoE4对神经突触可塑性的作用是有争议的[28-30]；apoE4是否对学习记忆的电生理细胞模型——在体海马晚期时相长时程增强（Later Phase Long Term Potentiation，L-LTP）的诱导和维持产生影响，目前还不清楚。另外，apoE4对两个在LTP诱导和维持中发挥重要作用的分子——钙/钙调素依赖的蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II, CaMKII)及cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的作用也不明确。因此，本研究采用在体电生理记录和分子实验技术系统探讨了apoE4的神经毒性作用及其分子机制。研究主要分为以下两部分：(1)采用在体大鼠海马CA1区场电位记录方法，观察了apoE4对L-LTP的诱导及其维持的影响；(2)电生理实验结束后，运用免疫组织化学技术和Western Blotting技术检测了CaMKII和CREB的表达水平及其磷酸化程度。为了证实apeE4的特异性，实验还采用apoE2作为对照。第一部分：apoE4引起大鼠在体海马晚期时相长时程增强的损伤为阐明apoE4在脑内的神经毒性作用，我们采用电生理手段记录大鼠在体海马场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)，观察了急性海马注射apoE4对对大鼠海马CA1区晚期时相的长时程增强(L-LTP)的影响，旨在探讨apoE4神经毒性作用的电生理学机制。实验选用成年雄性SpragueDawley (SD)大鼠，麻醉后固定于脑立体定位仪上，将自制的绑定电极（同心圆双极刺激电极和单极记录电极）及注药管精确插入到海马的刺激、记录及给药部位。在不同时间点给药，并且通过给予海马Schaffer侧枝单个测试刺激、双脉冲刺激及三组高频刺激(high frequency stimulations, HFSs)，在海马CA1区放射层诱发和记录基础fEPSP、配对脉冲引起的双脉冲易化(paired pulse facilitation,PPF)以及HFSs引起的L-LTP。观察药物对基础fEPSP、PPF及L-LTP的影响。实验结果：(1)各种药物包括高浓度的apoE4对基础的突触传递没有影响；(2)HFSs成功诱导了生理盐水对照组及apoE2对照组中大鼠海马L-LTP。生理盐水对照组的平均fEPSP幅度在HFSs后1分钟、60分钟和180分钟时分别是211±7.2%、170.4±4.5%和161.2±3.3%；apoE2对照组中HFSs后相同时间点的平均fEPSP幅度分别是210.8±8.4%、168.4±4.9%和157.75±3.6%。两组之间无明显差异(P>0.05)。HFSs前注射0.2μg apoE4后，海马L-LTP的诱导和维持受到显著抑制，平均fEPSP幅度在以上三个时间点分别是178.3±5.8%、149.7±5%和142.2±5%，较两对照组明显降低（P<0.01）。(3)HFSs后注射0.2μg apoE4对L-LTP的维持有轻微但不显著的抑制作用，平均fEPSP幅度在HFSs后60分钟和180分钟分别是155.5±6.5%和143.5±7.9%（P>0.05）。即便给予大剂量apoE4（2μg）后，仍然没有对L-LTP的维持构成抑制作用，平均fEPSP幅度在两个时间点为152.2±6.6%和150.7±4.2%（P>0.05）。(4)实验各组的PPF没有显著的统计学差异，提示apoE4对L-LTP诱导的抑制作用不是通过突触前神经递质的释放介导的。结论：apoE4在HFSs前注射损伤海马L-LTP，而HFSs后注射则没有损伤作用。这表明apoE4的神经毒性作用主要是对L-LTP诱导的抑制，而对维持没有抑制作用。此外，未受影响的PPF表明ApoE4的L-LTP诱导的抑制作用可能是作用在突触后的信号通路。第二部分：ApoE4神经毒性作用的分子机制实验采用电生理实验后大鼠的脑组织，分别进行了免疫组织化学技术和Western Blotting技术实验，检测了CaMKIIα和CREB的总蛋白含量及其磷酸化水平。旨在寻找apoE4抑制L-LTP的突触后信号通路的作用靶点，探讨apoE4伤害L-LTP的分子机制。实验结果：(1)免疫组织化学实验表明，HFSs前注射0.2μg apoE4不影响CaMKII和CREB总蛋白量的表达。其光密度分别是0.241±0.002和0.249±0.004(p>0.05)。在检测CaMKII和磷酸化CREB实验中，对照组中光密度分别分别为0.250±0.008和0.275±0.002。相反，apoE4注射组明显降低了两种蛋白的磷酸化水平，其光密度分别是0.094±0.002和0.170±0.002(p<0.01)。Western Blotting实验也证实了这一点。注射apoE4后，磷酸化的CaMKII和CREB分别降到了对照组的61.74±5.36%和64.80±12.58%(p<0.05)。而总蛋白量没有变化，分别是对照组的97.25±4.57%和95.24±11.45%(p>0.05)。(2)免疫组织化学实验发现，HFSs后注射apoE4不改变CaMKII和CREB的总蛋白量及其磷酸化水平。注射0.2μg apoE4后，磷酸化的CaMKII和CREB的光密度分别是0.231±0.011和0.274±0.003(p>0.05)；注射2μg apoE4后，磷酸化的CaMKII和CREB的光密度分别是0.228±0.003和0.278±0.003(p>0.05)。与免疫组化实验相似，Western Blotting也表明无论0.2μg还是2μg的apoE4，CaMKII和CREB的总蛋白量和磷酸化水平都没有改变(p>0.05)。结论：apoE4通过降低CaMKIIα和CREB磷酸化水平损伤了海马L-LTP，CaMKIIα and CREB是apoE4发挥神经毒性作用的重要的细胞内靶点。总之，本研究利用在体电生理场电位记录技术、免疫组织化学技术和Westerm Blotting技术，通过观察大鼠在体海马L-LTP及CaMKIIα、CREB的总蛋白量和磷酸化水平，探讨了apoE4神经毒性作用及其分子机制。结果证实，急性apoE4注射可以损伤海马L-LTP，并且这种神经毒性是通过降低突触后磷酸化CaMKIIα和磷酸化CREB活性而实现的。本研究为apoE4的神经毒性作用提供了进一步的电生理和分子生物学实验证据，为预防和治疗AD提供了新的线索。