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目的基于多色流式细胞术平台,建立多色标记检测外周血免疫标记用于辅助诊断结核病（简称TB.FACS）,并初步探讨机体免疫机制对结核病发生发展的影响。方法1.收集结核病患者148例、非结核疾患99例、健康人23例。将每个受试者的外周血经结核杆菌特异性抗原蛋白ESAT-6和CFP-10刺激培养,利用多色流式细胞术检测细胞表面免疫标记CD64、HLA-DR、CD69、HLA-G和CD134。并对培养条件进行优化,比较不同浓度的结核杆菌特异性抗原蛋白以及培养时间对检测免疫标记的影响。2.绘制ROC曲线,得出最具诊断意义的免疫标记包括各自的特异性、灵敏度、阳性预测值和阴性预测值,制定诊断方案和标准。3.收集了113例疑似结核的患者进行临床双盲实验,其中最终临床确诊为结核病的患者有45例,其余68例患者均为非结核病人。用流式细胞术分别检测细胞表面免疫标记,并根据ROC曲线的结果制定各个免疫标记的诊断标准并对结果进行判断,以此验证其诊断结核的效率并探寻诊断结核的最佳免疫标记。4.根据单一免疫标记的ROC曲线的结果制定了不同免疫标记组合的诊断方案及其诊断标准,并按照其诊断标准对193例结核病患者,167例非结核病人和23例健康人进行结果判读,以此来确定诊断结核的最佳方案,并命名为TB.FACS。5.TB.FACS分别与诊断结核的其他实验室方法进行比较（结核杆菌培养、涂片找结核分枝杆菌、TB.IGRA）,以此来探讨TB.FACS诊断结核的价值。6.收集结核病患者68例、非结核疾患组30例、健康人组20例。并收集每个受试者的外周血经结核杆菌特异性抗原蛋白ESAT-6和CFP-10刺激培养离心后的上清,利用CBA技术检测培养上清中细胞因子谱的水平。7.绘制ROC曲线,得出最具诊断意义的细胞因子包括各自的特异性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值。经logistic回归模型实现细胞因子两两联合诊断结核,绘制ROC曲线,确定细胞因子分别两两联合后的最佳组合。8.收集10例结核患者和6例健康人组的PMBC,应用抗CD134单抗阻断CD134/CD134L共刺激通路,观察CD134/CD134L共刺激分子对Th1/Th2细胞因子谱表达的影响。结果1.结核培养体系中测定管的结核杆菌特异性抗原蛋白ESAT-6和CFP-10浓度为5.0μg/m L,并且培养时间为24h为最优条件。经统计学分析,结核组的CD64指数,T细胞表面HLA-G、CD69和CD134的测定管-阴性对照管的荧光强度（T-N）以及HLA-DR指数,单核细胞DR百分比的阴性对照管-测定管的荧光强度（N-T）明显高于非结核疾患组和健康对照组,P均小于0.05;而CD64指数,HLA-DR指数,单核细胞DR百分比,T细胞表面HLA-G、CD69和CD134阴性对照管与测定管的差值在非结核疾患组和健康人组之间无统计学差异,P均大于0.05。2.根据ROC曲线的结果,CD64指数的ROC曲线下的面积（AUC）为81.5%,截断值为0.617,灵敏度为0.824,特异性为0.656,阳性预测值0.630,阴性预测值0.847,阳性似然比2.395,阴性似然比0.268;DR指数的ROC曲线下的面积（AUC）为70.1%,截断值为1.222,灵敏度为0.757,特异性为0.590,阳性预测值0.558,阴性预测值0.771,阳性似然比1.846,阴性似然比0.412;DR百分比的ROC曲线下的面积（AUC）为82.0%,截断值为2.950,灵敏度为0.743,特异性为0.820,阳性预测值0.737,阴性预测值0.789,阳性似然比4.127,阴性似然比0.313;HLA-G的ROC曲线下的面积（AUC）为79.2%,截断值为2.250,灵敏度为0.703,特异性为0.787,阳性预测值0.697,阴性预测值0.788,阳性似然比3.300,阴性似然比0.377;CD69的ROC曲线下的面积（AUC）为88.6%,截断值为0.750,灵敏度为0.851,特异性为0.836,阳性预测值0.738,阴性预测值0.886,阳性似然比5.189,阴性似然比0.178;CD134的ROC曲线下的面积（AUC）为86.8%,截断值为1.250,灵敏度为0.824,特异性为0.836,阳性预测值0.716,阴性预测值0.868,阳性似然比5.024,阴性似然比0.210。3.经临床双盲试验,CD64的灵敏度为0.800,特异性为0.691,阳性预测值0.787,阴性预测值0.839,阳性似然比2.589,阴性似然比0.289,诊断符合率0.734。DR指数的灵敏度为0.755,特异性为0.574,阳性预测值0.539,阴性预测值0.780,阳性似然比1.768,阴性似然比0.591,诊断符合率0.646。DR百分比的灵敏度为0.733,特异性为0.794,阳性预测值0.702,阴性预测值0.788,阳性似然比3.558,阴性似然比0.336,诊断符合率0.734。HLA-G的灵敏度为0.667,特异性为0.750,阳性预测值0.638,阴性预测值0.773,阳性似然比2.668,阴性似然比0.444,诊断符合率0.717。CD69的灵敏度为0.822,特异性为0.824,阳性预测值0.755,阴性预测值0.875,阳性似然比4.670,阴性似然比0.216,诊断符合率0.823。CD134的灵敏度为0.800,特异性为0.838,阳性预测值0.766,阴性预测值0.864,阳性似然比5.882,阴性似然比0.239,诊断符合率0.823。4.TB.FACS的诊断标准制定为:CD69＜0.750、CD134＜1.250,其中这两者中有一个大于或都大于等于cutoff值,即判定该标本为结核阳性。该方案的灵敏度为0.922,特异性为0.852,阳性预测值0.864,阴性预测值0.915,阳性似然比6.229,阴性似然比0.091,诊断符合率0.888。5.TB.FACS与结核杆菌培养,涂片找结核分枝杆菌相比,其诊断结核的灵敏度要明显升高,P＜0.05。TB.FACS与TB.IGRA的灵敏度无统计学差别,P＞0.05,但TB.FACS检测的特异性要明显高于TB.IGRA,P＜0.05。6.经统计学分析,结核组IL-2,IFN-γ、TNF-α和IL-6水平（T-N）明显高于非结核疾患组和健康对照组,P＜0.05;而结核组IL-4,IL-10,IL-17（T-N）的水平与非结核疾患组和健康对照组相比均无统计学差异,P＞0.05。7.根据ROC曲线的结果,发现IL-2联合IFN-γ的ROC曲线下的面积（AUC）最大为91.2%,截断值为0.588,灵敏度为0.851,特异性为0.923,阳性预测值0.966,阴性预测值0.706,阳性似然比11.051,阴性似然比0.161;其中,单一细胞因子IL-2的ROC曲线下的面积（AUC）为83.4%,截断值为2.330,灵敏度为0.894,特异性为0.776,阳性预测值0.909,阴性预测值0.741,阳性预测值0.909,阴性预测值0.741;IFN-γ的ROC曲线下的面积（AUC）为90.5%,截断值为7.325,灵敏度为0.821,特异性为0.923,阳性预测值0.965,阴性预测值0.667,阳性似然比10.662,阴性似然比0.193。8.体外阻断CD134/CD134L共刺激途径后,经CBA流式检测发现:结核患者在抗CD3ε单抗以及r IL-2刺激前,其PBMC培养液上清分泌的细胞因子,包括（IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ）水平较健康对照组明显升高;细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ）的分泌在抗CD3ε单抗以及r IL-2刺激下,又显著高于TB培养对照组;TB抗CD134阻断组的Th2细胞因子（IL-4、IL-6）在抗CD3ε单抗以及r IL-2活化刺激T细胞后,其分泌水平较TB培养刺激组明显下降,而Th1细胞因子（IL-2,IFN-γ）其分泌水平较TB培养刺激组明显上升（P＜0.05）。结论1.基于流式细胞术平台,通过结核杆菌特异性蛋白培养全血建立多色标记检测细胞表面免疫标记用于辅助诊断结核病的方法。其中CD69联合CD134诊断结核病的灵敏度明显优于传统的临床诊断结核的方法,如结核杆菌培养,涂片找结核分枝杆菌等。与TB.IGRA比较,TB.FACS不仅诊断结核的特异性高,并且具有快速,简便,可单标本随时检测的优点。2.通过CBA检测结核标本培养上清中的细胞因子发现,细胞因子的两两联合能提高结核的诊断效率,其中IL-2联合IFN-γ是诊断结核的最佳组合。此外,CBA具有多种细胞因子同时检测并且灵敏度高的优点。3.结核病患者中Th1以及Th2类细胞因子都存在异常活化。体外阻断T细胞活化的正性共刺激分子CD134发现,Th1/Th2的平衡向Th1偏移,推测结核病的免疫机制与T细胞异常活化以及Th1/Th2细胞因子的失衡密切相关。