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禽心包积液肝炎综合征(hepatitis-hydropericardiμm syndrome,HHS)是一种以急性感染为主的家禽传染病。该病由高致病性禽腺病毒血清4型(Fowl Adenovirus,FAd V-4)引起,1987年在巴基斯坦的安卡拉(Angara)被首次发现,因而又被称为安卡拉病。2015年以来,我国福建、陕西、河南、河北、山东、安徽、辽宁等多个省区都发生了HHS疫情,给这些地区的禽类养殖行业带来了严重损失。FAd V-4主要侵染宿主肝细胞、内皮细胞以及淋巴细胞,能造成肝脏和心脏明显的组织病变,特别是能引起肝细胞中产生大量的嗜碱性包涵体。目前有关FAd V-4的致病机制,尤其是其进入宿主细胞的机制仍不清楚。本文以鸡肝癌细胞(Leghorn male hepatocellular,LMH)为细胞模型,开展FAd V-4进入细胞过程中宿主细胞基因变化及其调控研究,结果如下:1.FAd V-4流行株的分离鉴定和多克隆抗体的制备。从陕西省疑似心包积液-肝炎综合症发病鸡场中采集病料,用鸡胚和LMH细胞分离到一株病毒。通过对其六邻体基因(hexon)和五邻体基因(penton)进行测序,并与Gen Bank公布的序列比对,该病毒相关基因与近年来我国多省区分离的FAd V-4同源性高达99.8%～99.9%。动物试验证明,该FAd V-4分离株能引起肉鸡出现典型临床症状和组织病理变化,还能引起LMH细胞出现细胞病变。采用原核表达FAd V-4分离株的六邻体和五邻体重组蛋白,经Ni柱亲和纯化后免疫新西兰白兔获得了多克隆抗体。ELISA方法检测表明,制备的抗体效价达1:512,000,为后续的研究提供了材料。2.FAd V-4进入LMH细胞过程中宿主细胞mi RNAs表达变化研究。使用小RNA测序技术研究了FAd V-4进入LMH细胞过程中不同时间点(30 min、60 min和120 min)差异表达小RNA,筛选得到了784个差异表达mi RNAs。在30 min、60 min和120 min时,LMH细胞分别有520个、312个和246个mi RNAs显著差异表达。通过对这些差异表达mi RNAs的靶基因进行GO功能分类和pathway富集分析,发现FAd V-4进入LMH细胞过程中这些mi RNAs的靶基因主要参与了如粘附连接和受体结合等与病毒进入密切相关的细胞功能,并富集在内吞和受体相互作用等信号通路。3.FAd V-4进入LMH细胞过程中宿主细胞m RNAs表达变化研究。使用转录组测序技术,研究了FAd V-4进入LMH过程中不同时间点(30 min、60 min和120 min)差异表达基因,筛选得到了724个显著差异表达m RNAs。在FAd V-4感染30 min、60 min和120 min时,宿主LMH细胞分别有90个、259个、和625个m RNAs差异表达。通过对这些差异表达m RNAs进行GO功能分类和pathway富集分析,发现这些m RNAs参与了如粘附连接和受体结合等与病毒进入密切相关的细胞功能,并富集在Toll样受体信号通路、TNF信号通路以及MAPK信号通路。4.FAd V-4进入LMH细胞过程中宿主细胞差异共表达mi RNAs-m RNAs研究。使用多组学关联分析方法,筛选得到了FAd V-4进入LMH细胞过程中856组差异共表达的mi RNAs-m RNAs关联对。在FAd V-4感染30 min、60 min和120 min时,分别筛选出41组、154组和661组差异共表达的负相关mi RNAs-m RNAs关联对。通过GO功能分类和pathway富集分析发现,这些差异共表达mi RNAs-m RNAs关联对主要富集在MAPK信号通路、TNF信号通路以及Toll样受体信号通路。5.gga-mi R-128-2-5p与OBSL1的相关性分析以及对FAd V-4进入细胞的调控研究。从差异共表达mi RNAs-m RNAs关联对中,选择gga-mi R-128-2-5p与OBSL1之间的调控关系进行研究。结果表明FAd V-4进入LMH细胞过程中能引起gga-mi R-128-2-5p表达量的下降,而OBSL1表达量升高。使用q PCR和双荧光素酶报告基因方法,研究发现gga-mi R-128-2-5p过表达可以明显抑制OBSL1表达,而干扰gga-mi R-128-2-5p可以促进OBSL1表达。通过q PCR和CLSM方法,进一步证明了gga-mi R-128-2-5p可以通过下调OBSL1的表达,进而抑制FAd V-4进入宿主细胞。综上所述,分离鉴定到一株高致病性FAd V-4,制备出六邻体和五邻体蛋白的多克隆抗体。使用高通量测序技术,研究了FAd V-4进入LMH细胞过程中不同时间点宿主细胞mi RNAs和m RNAs的变化情况。通过多组学关联分析,筛选得到了FAd V-4进入LMH细胞过程中,细胞显著差异共表达的mi RNAs-m RNAs关联对。进一步研究,证实了宿主gga-mi R-128-2-5p可以通过下调其靶基因OBSL1的表达,抑制FAd V-4进入LMH细胞。研究结果为深入理解FAd V-4的致病机制提供了实验数据和理论依据。