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牡丹（Paeonia suffruticosa）花大艳丽,花型丰富,色彩多样,具有极好的观赏和药用价值。牡丹是多年生落叶灌木,与传统育苗技术相比,组织培养技术有利于牡丹育种和快速繁殖。然而,组培苗存在着生根质量差、不定根与茎部的维管束不连接等问题,严重限制了牡丹的快速繁殖。本课题组前期克隆得到不定根发生相关加氧酶（Adventitious rooting related oxygenase,ARRO-1）基因的c DNA全长序列,亚细胞定位于质膜,在不定根原基形成时期的表达量最高,是牡丹不定根发育过程的关键基因。基于前期研究成果,本研究通过构建牡丹不定根不同发育时期的c DNA文库,利用膜蛋白酵母双杂交技术筛选出与牡丹PsARRO-1互作的蛋白,并结合牡丹不定根发育关键时期转录组分析,初步解析PsARRO-1互作基因的表达情况与功能,为牡丹不定根发生相关基因调控网络的构建提供技术支撑,为研究牡丹不定根发生分子机理及解决牡丹组培苗生根问题提供理论支撑。主要研究成果如下:1.‘凤丹’牡丹不定根酵母双杂交文库的构建采集不同发育阶段的‘凤丹’牡丹（P.ostii）不定根,通过改良CTAB法提取总RNA,分离纯化m RNA,进而合成双链c DNA,利用Clone Miner?II c DNA Library Construction Kit构建了‘凤丹’牡丹不定根酵母双杂交文库。检测发现,构建的p PR3-N膜体系酵母双杂交文库的库容量为6.5×10~6 cfu/m L,总克隆数为1.3×10~7 cfu,插入片段主要集中在500-3000 bp之间,重组率为100%,指标合格,可以用来进行互作蛋白的筛选。2.‘凤丹’牡丹PsARRO-1互作蛋白的筛选根据牡丹PsARRO-1基因的c DNA序列,设计特异引物,通过Sfi I酶切构建p BT3STE-ARRO和p BT3SUC-ARRO诱饵载体;在酵母细胞中进行自激活及功能检测发现,p BT3STE-ARRO和p BT3SUC-ARRO诱饵质粒都没有自激活能力,p BT3SUC-ARRO的功能更强;后续选用p BT3SUC-ARRO筛选p PR3-N膜体系牡丹不定根酵母双杂交文库,得到36个阳性克隆转化子,发现36个阳性克隆全部能够激活HIS3、ADE2和MEL1报告基因;菌落PCR、测序和回转验证结果表明,有18个阳性克隆与PsARRO-1存在着相互作用。3.‘凤丹’牡丹不定根发育关键时期的转录组分析采取不同发育阶段的‘凤丹’牡丹（P.ostii）不定根,进行转录组测序,共获得了141.77 Gb的测序数据,其中50.44%的unigenes得到注释,4个时期（根原基形成前期、根原基形成期、根凸起、根长出）分别鉴定到128571、163869、168379、170004条高质量的reads。根原基形成期与根原基形成前期相比,48031个基因上调,23687个基因下调;根凸起期与根原基形成期相比,上调基因有21165个,下调基因有8639个;根长出期与根凸起时期相比,上调基因与下调基因数量相差不大,分别为13556和11156个,根原基形成前期到根原基形成期的基因表达变化剧烈,有大量基因参与了不定根的形成过程。通过对激素特别是生长素通路基因表达量分析发现,有大量激素相关基因在牡丹不定根根原基形成前期特异性高表达,如生长素关键基因ARF6、ARF8、ARF2B、IAA9、IAA11、IAA16、GH3.5、GH3.6、LAX5、SAUR71、TIR1等,乙烯通路相关基因ERF113、ERF020、ERF071、ERF4、TOE038等,油菜素内酯相关基因BSK3、BEH4、CYCD3-1、CYCD3-3等均在根原基形成前期特异性高表达,可能是牡丹不定根发生的重要基因。而细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、水杨酸、茉莉酸等作为不定根发育的负调控因子,与生长素相互影响,共同调控牡丹不定根发育过程。另外,还有大量的氧化酶活性相关基因在牡丹不定根发育中高表达,PER21、PER70、PER52、PNC1、SOD1等在根原基形成前期高表达,是不定根发育的重要氧化酶活性基因。4.‘凤丹’牡丹PsARRO-1互作基因的生物信息学分析将通过酵母双杂交文库筛选获得的18个PsARRO-1互作基因与转录组的序列进行比对,共有15个PsARRO-1互作基因可注释到牡丹不定根发育关键时期转录组数据库中。蛋白质稳定性预测结果表明,Unigene899＿All、CL5321.Contig1＿All、CL1669.Contig2＿All、Unigene43742＿All和CL683.Contig2＿All蛋白属于稳定蛋白,其余均为不稳定蛋白。蛋白质亲水性预测结果表明,仅有CL5321.Contig1＿All、CL4478.Contig1＿All、CL12001.Contig3＿All和Unigene43742＿All蛋白属于疏水蛋白,其余均为亲水蛋白。信号肽预测结果显示,只有CL18524.Contig2＿All蛋白可能存在信号肽。跨膜结构域预测结果显示,Unigene43426＿All、CL4478.Contig1＿All、CL8996.Contig1＿All和Unigene43742＿All蛋白存在跨膜结构域。保守结构域预测结果表明,15个蛋白质保守结构域各不相同,其中Unigene43426＿All并未预测到保守结构域。转录组注释结果表明,牡丹HMGB3（CL5321.Contig1＿All）主要在不定根长出期高表达;牡丹POT2（CL4478.Contig1＿All）基因在根原基凸起期高表达;牡丹Cyb5（CL8996.Contig1＿All）基因在根原基形成前期高表达。由此推测,PsARRO-1基因可能与PsHMGB3、PsPOT2、PsCyb5存在相互作用,共同调控牡丹不定根的生长和发育。5.‘凤丹’牡丹PsARRO-1互作基因的克隆与功能分析以转录组数据为参考,设计基因特异引物,以‘凤丹’牡丹不定根的c DNA为模板进行扩增,获得PsHMGB3、PsPOT2、PsCyb5基因的编码区序列,进行了编码氨基酸序列比对和进化分析。点对点酵母双杂交和双分子荧光互补试验结果表明,PsARRO-1与PsHMGB3在细胞核中存在互相作用,PsARRO-1与PsPOT2、PsCyb5可能不存在互相作用。因此,对PsHMGB3基因进行了表达分析和功能研究,发现该基因在牡丹不定根的不同发育时期都有一定的表达,主要在牡丹不定根长出时期高表达,基因的表达量随着不定根的发育呈上调趋势;亚细胞定位于细胞核内;构建p CAMBIA1301-PsHMGB3载体转化拟南芥,发现PsHMGB3基因的过表达能够导致拟南芥植株的主根变长、侧根增多,影响了植株的根发育过程。