前言 分子生物学技术作为新技术革命的重要组成部分涉及到生命科学研究领域的各个方面，在现代环境卫生学的研究内容中，无法快速得到目的蛋白或多肽成为制约其发展的一项重要因素。利用蛋白质表达技术，快速、简便地进行有关活性代谢产物的高效表达进而研究其生物学功能和理化特性成为一种新的方法。其中融合蛋白表达技术由于容易实现高效表达、纯化步骤简便、产物多以活性形式存在而得到广泛应用，尤其在小分子多肽研究中受到亲睐，为研究蛋白质发挥作用机理的活性中间产物的理化性质和生物学作用开辟了新天地。 硫氧还原蛋白(Trx)是一种热稳定性蛋白分子伴侣，在多种情况下，可使异源蛋白质正确的折叠，表现出全部生物学活性，具有的热稳定性常可作为纯化Trx融合蛋白的方式而倍受重视，但目前使用的载体表达效率不高，表达产物需要蛋白酶切割，并且其第38位为甲硫氨酸，是特异性裂解的酶切位点，在使用溴化氰作定点切除时，无法得到单一的目的片段产物而限制了其应用。由于Trx具有分子较小，结构简单，易于改造的特点，本研究采用基因定点突变技术，对其基因进行了改造，构建了新型硫氧还原蛋白载体并以线虫抗凝肽(ATP)为模型，对纯化方法及及其活性进行了初步的研究。 材料与方法 实验所用的大肠杆菌株菌是BL21(DE3)、DH5α；所用载体为pETlla、pCDNAⅡ；实验所用的试剂、各项实验操作均遵照J．萨姆布鲁克上．F．弗里奇J．曼尼阿蒂斯著的《分子克隆实验指南》一书上介绍的相关方法进行。 1．通过PCR技术合成Trx突变点前后片段，再利用重叠延伸法合成含突变位点的xm基因全长片段；同时扩增ATP基因，将PCR扩增的目的基因产物分别连接到 pCDNA 11载体上，经限制性内切酶切反应鉴定无误，DNA序列分析，证明PCR产物序列完全正确，突变位点与预期相符。 2．将正确突变后的 Tn基因连接到 pETlla的载体上，得到新型融合表达载体十ET－Trx，将 pCDNA 11－ATP用 Xh。I＋BamH双酶切，回收目的片段ATP，插人pET－Trx相应位点，得到PET－TfATP表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3人用MG诱导表达。 3．对Trx－ATP融合蛋白的纯化方法进行了摸索。比较了不同温度、同一温度不同作用时间的高温热变性对纯化结果的影响；研究了金属 Ni人螫合层析和 Q－Sepharose Fst Flow离子交换层析的纯化效果。 4．对纯化的Trx－ATP融合蛋白的生物学功能一抗凝活性进行了测定，各取20gi按比例稀释的融合蛋白Trx－ATP加人到200 gi用拘椽酸钠处理过的正常血浆中，混匀置于37℃水浴20dn，取50 gi上述液体与0．025。l／L CaC12和凝血活酶混合液混合至0．IInl，开始检测凝血酶原时间，测定其活性。 实验结果 构建了第 38位氨基酸突变的 Trx蛋白融合表达载体 PET－Trx。将ATP基因插入该载体得到pET－TdATP，转化E．COltBInpE3LIPYG诱导3h后，通过 SDS－PAGE、兔抗 ATP抗体行Western－blot确证融合蛋白得以高效表达，表达产物可占菌体蛋 ·2·白总量的20％，主要以可溶性形式表达。 通过比较几种纯化方法的效果，综合考虑蛋白的得率、纯度与活性之间的关系，确定了PET－TdA7T纯化的纯化策略为：先将大肠杆菌菌体裂解物于 85。90℃加热 10ndn，目的蛋白纯度可达60％以上、随后以 Q－SePharose FastFIOw离子交换层析进行纯化，融合蛋白纯度最高可达90％左右。 测活结果表明Trx－ATP融合蛋白具有抗凝活性，这表明Trx融合蛋白保持了目的蛋白的活性。 讨 论 1．关于PCR PCR介导产生突变体设计的共同点是均无需单链DNA中间产物。这就回避使用M13噬菌体载体，或其他辅助病毒来制备单链DNA，从而缩短了实验时间。这种定点突变是重组DNA进化的基础，可用来改变DNA序列从而改变蛋白质编码基因，进而研究该基因的生物学功能，是DNA体外修饰最常用的方法。本研究中在具体的操作技术上采用的是重叠延伸技术，将Trx第38位的甲硫氨酸（MetX突变为丙氨酸（Ala人去除了演化氰裂解时产生多个片段这一不利条件，从而得到单一目的片段。裂解后产物利用色谱纯化，很容易得到与TIx相融合表达的蛋白、肽类或其它物质，与酶裂解法相比，纯化成本大大降低，便于研究目的蛋白的相关性质。 2．关于载体构建 本文构建的Trx融合表达载体的优点具体表现为： Trx具有耐热性，融合蛋白在80℃温度几十分钟内保持不变性，而大部分杂蛋白均已变性。此性质可作为分离纯化蛋白切实有效的理论依据，不向Trx融合蛋白体系中添加任何杂质，仅通过 ·3·高温热变性就可得到一定的纯化效果，具有实际应用意义。 Tx蛋白序列中已分散插人一些含组氨酸的残基，而具有与金属离子螫合的性质，可采用金属螫合层析进行分离纯化，洗脱杂蛋白和目的蛋白时咪哇的浓度接近，影响纯化结果；Ni卜与