【摘 要】
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柠檬型克勒克酵母34-9(Kloeckera apiculata)是本课题组从柑橘园土壤中分离纯化得到的一株生防酵母菌,其对柑橘采后青绿霉病的拮抗作用包括营养竞争及产生抑菌物质苯乙醇等方
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柠檬型克勒克酵母34-9(Kloeckera apiculata)是本课题组从柑橘园土壤中分离纯化得到的一株生防酵母菌,其对柑橘采后青绿霉病的拮抗作用包括营养竞争及产生抑菌物质苯乙醇等方面。但仍具有一系列不利于商业化运用的问题,如生物量低、防治效果不稳定等。为了提高生防菌34-9的防治效果,需要对其进行基因水平上的改良,本实验对原生质体法和根癌农杆菌介导的转化技术对34-9转化的条件进行优化,初步建立了的34-9的遗传转化体系,为下一步进行基因改良提供技术支撑。主要研究结果如下：1.确定了34-9原生质体形成与再生的适宜条件：培养12h至对数期的酵母,酵母细胞浓度108CFU(colony-forming unit)/mL,0.7mol/L的NaCl作为渗透压稳定剂,经0.3%B-巯基乙醇和1g/L的EDTA-Na2预处理,用1.5%蜗牛酶和0.4%纤维素酶采取28℃摇床2h的方式进行酶解。2.初步建立了农杆菌介导34-9酵母的遗传转化体系,并对农杆菌浓度、酵母浓度、共培养膜的类型及共培养时间等进行优化。结果表明：利用携带双元质粒pTFCM农杆菌菌株AGL-1,农杆菌浓度OD600为0.3,酵母浓度为1×107CFU/mL,在预培养和共培养过程中都添加200μmol/L AS,25℃避光诱导培养48h可获得转化子。3.通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,获得转化子,其中一部分连续传代10次能够稳定性遗传,并对其进行PCR检测表明,hph基因已成功转入34-9中。
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