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背景：糖尿病(DM)患者常处于高血糖、脂代谢紊乱、高血压等多重危险因素簇集的状态，这些危险因素互相影响，共同促进动脉粥样硬化(AS)的发生与发展。AS是心脑血管疾病的病理基础，内皮功能障碍(ED)不仅是AS发生的始动环节，也是促进其进展的重要因素，但是ED的发病机制极其复杂，至今尚未完全阐明。
血管内皮细胞中的自噬是针对许多病理生理刺激的一种保护机制。近年来研究发现，自噬与ED及AS的发生发展均密切相关。当内皮受到氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、晚期糖基化终末产物(AGEs)等刺激时，内皮细胞可通过激活自身自噬来抵抗内皮炎症反应或氧化应激，而自噬受损可能是引发ED的主要机制之一。细胞自噬的发生是多因素参与的复杂过程，可受雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径的负向调控。硒蛋白S(SelS)是一种跨膜的糖调节蛋白，可通过抗氧化应激、炎症反应、凋亡等途径发挥内皮保护作用。但SelS能否通过调节Akt/mTOR自噬通路保护内皮免受高糖和/或高脂的损伤尚不清楚。本研究拟通过观察不同SelS表达水平对高糖和/或高脂诱导的血管内皮损伤及Akt/mTOR自噬通路的影响，探讨SelS对内皮保护作用及可能机制，为SelS成为防治AS新的、有效的干预靶点提供实验依据及理论基础。
方法：利用不同浓度糖或脂干预人主动脉内皮细胞(HAECs)，测定细胞生存率，构建高糖和/或高脂诱导HAECs损伤模型。应用WesternBlot方法检测内皮一氧化氮合酶(eNOS )、内皮素-1(ET-1 )、细胞间粘附因子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)及SelS蛋白表达水平的变化，探讨高糖和/或高脂对HAECs损伤与SelS的关系。应用透射电镜观察高糖和/或高脂干预后HAECs自噬小体，荧光显微镜观察指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集，WesternBlot方法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1表达及Akt/mTOR磷酸化水平的变化，探讨高糖和/或高脂诱导HAECs损伤与自噬及Akt/mTOR自噬通路的关系；应用慢病毒感染技术获得过表达及低表达SelS的HAECs，高糖和/或高脂干预过表达或低表达SelS的HAECs，应用WesternBlot方法检测eNOS、ET-1、ICAM-1，荧光显微镜观察指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集，WesternBlot方法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1表达及Akt/mTOR自噬通路蛋白磷酸化水平的变化，探讨调节SelS表达对高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤及Akt/mTOR自噬通路的影响。
结果：成功构建高糖和/或高脂诱导HAECs损伤模型：高糖(Glu 35mmol/L )干预导致HAECs存活率为(76.57±4.47)%，高脂(ox-LDL 50mg/L )干预导致HAECs存活率为(72.74±6.59)%，高糖联合高脂(35mmol/LGlu+50mg/Lox-LDL)干预导致HAECs存活率为(55.84±5.35)%。高糖和/或高脂干预下，eNOS蛋白水平呈时间依赖性减少(P＜0.05)，ET-1、ICAM-1蛋白水平呈时间依赖性增加(P＜0.05)，表明随高糖和/或高脂干预时间的延长，HAECs损伤逐渐加重。高糖和/或高脂干预下，SelS蛋白水平呈时间依赖性增加(P＜0.05)，提示，SelS与高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤有关。
高糖和/或高脂诱导HAEC自噬水平先增加后减少，干预6h自噬水平最高。高糖和/或高脂干预HAECs6h时，导致HAECs损伤：eNOS表达减少，ET-1、ICAM-1表达增加，尤以高糖联合高脂组最为显著(P＜0.05)；同时伴有SelS表达增加，其中高糖联合高脂组与高脂组增加最显著(P＜0.05)；均导致HAECs自噬显著增加：自噬小体增加，指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集增加，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达增加，自噬产物降解相对不足，P62表达增加，其中高糖联合高脂组增加最显著(P＜0.05)。高糖和/或高脂干预6h时，HAECs表达p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值均显著减少，提示Akt/mTOR通路受到抑制，其中高糖联合高脂组抑制最显著(P＜0.05)。高糖和/或高脂干预6h时，SelS表达均增加，其中高糖联合高脂组及高脂组较高糖组增加更显著(P＜0.05)，提示SelS可能与高糖和/或高脂诱导的HAECs自噬及Akt/mTOR通路有关。
过表达SelS能改善高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤：显著增加eNOS表达水平，显著降低ET-1、ICAM-1表达水平(P＜0.05)；抑制HAECs自噬：显著减少指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集，减少LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平，增加P62蛋白表达(P＜0.05)。而低表达SelS时，与过表达SelS结果正好相反，使高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤进一步加重：显著减少eNOS表达，增加ET-1、ICAM-1表达水平(P＜0.05)；激活HAECs自噬：增加指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集，增加LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达，减少P62蛋白表达(P＜0.05)。过表达SelS时，高糖和/或高脂诱导HAECs表达p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值增加(P＜0.05)，提示Akt/mTOR通路被激活；低表达SelS时，高糖或高脂诱导HAECs表达p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值减少(P＜0.05)，提示Akt/mTOR通路被抑制。
结论：
1.高糖和/或高脂以时间依赖的趋势损伤内皮细胞，同时伴有自噬水平和SelS蛋白表达水平的变化，提示SelS与高糖和/高脂导致的内皮损伤及自噬有关。
2.高糖和/或高脂诱导HAEC自噬呈先增加后减少的动态变化，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值显著减少，SelS表达增加，提示SelS与高糖和/或高脂诱导的内皮细胞损伤及Akt/mTOR通路有关。
3.高表达SelS时，Akt/mTOR通路激活，HAEC自噬受抑制，高糖和/或高脂诱导的内皮细胞损伤改善；而低表达SelS与此结果相反。表明SelS可能通过调节Akt/mTOR自噬通路保护内皮免受高糖和/或高脂的损伤。
血管内皮细胞中的自噬是针对许多病理生理刺激的一种保护机制。近年来研究发现，自噬与ED及AS的发生发展均密切相关。当内皮受到氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、晚期糖基化终末产物(AGEs)等刺激时，内皮细胞可通过激活自身自噬来抵抗内皮炎症反应或氧化应激，而自噬受损可能是引发ED的主要机制之一。细胞自噬的发生是多因素参与的复杂过程，可受雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径的负向调控。硒蛋白S(SelS)是一种跨膜的糖调节蛋白，可通过抗氧化应激、炎症反应、凋亡等途径发挥内皮保护作用。但SelS能否通过调节Akt/mTOR自噬通路保护内皮免受高糖和/或高脂的损伤尚不清楚。本研究拟通过观察不同SelS表达水平对高糖和/或高脂诱导的血管内皮损伤及Akt/mTOR自噬通路的影响，探讨SelS对内皮保护作用及可能机制，为SelS成为防治AS新的、有效的干预靶点提供实验依据及理论基础。
方法：利用不同浓度糖或脂干预人主动脉内皮细胞(HAECs)，测定细胞生存率，构建高糖和/或高脂诱导HAECs损伤模型。应用WesternBlot方法检测内皮一氧化氮合酶(eNOS )、内皮素-1(ET-1 )、细胞间粘附因子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)及SelS蛋白表达水平的变化，探讨高糖和/或高脂对HAECs损伤与SelS的关系。应用透射电镜观察高糖和/或高脂干预后HAECs自噬小体，荧光显微镜观察指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集，WesternBlot方法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1表达及Akt/mTOR磷酸化水平的变化，探讨高糖和/或高脂诱导HAECs损伤与自噬及Akt/mTOR自噬通路的关系；应用慢病毒感染技术获得过表达及低表达SelS的HAECs，高糖和/或高脂干预过表达或低表达SelS的HAECs，应用WesternBlot方法检测eNOS、ET-1、ICAM-1，荧光显微镜观察指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集，WesternBlot方法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1表达及Akt/mTOR自噬通路蛋白磷酸化水平的变化，探讨调节SelS表达对高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤及Akt/mTOR自噬通路的影响。
结果：成功构建高糖和/或高脂诱导HAECs损伤模型：高糖(Glu 35mmol/L )干预导致HAECs存活率为(76.57±4.47)%，高脂(ox-LDL 50mg/L )干预导致HAECs存活率为(72.74±6.59)%，高糖联合高脂(35mmol/LGlu+50mg/Lox-LDL)干预导致HAECs存活率为(55.84±5.35)%。高糖和/或高脂干预下，eNOS蛋白水平呈时间依赖性减少(P＜0.05)，ET-1、ICAM-1蛋白水平呈时间依赖性增加(P＜0.05)，表明随高糖和/或高脂干预时间的延长，HAECs损伤逐渐加重。高糖和/或高脂干预下，SelS蛋白水平呈时间依赖性增加(P＜0.05)，提示，SelS与高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤有关。
高糖和/或高脂诱导HAEC自噬水平先增加后减少，干预6h自噬水平最高。高糖和/或高脂干预HAECs6h时，导致HAECs损伤：eNOS表达减少，ET-1、ICAM-1表达增加，尤以高糖联合高脂组最为显著(P＜0.05)；同时伴有SelS表达增加，其中高糖联合高脂组与高脂组增加最显著(P＜0.05)；均导致HAECs自噬显著增加：自噬小体增加，指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集增加，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达增加，自噬产物降解相对不足，P62表达增加，其中高糖联合高脂组增加最显著(P＜0.05)。高糖和/或高脂干预6h时，HAECs表达p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值均显著减少，提示Akt/mTOR通路受到抑制，其中高糖联合高脂组抑制最显著(P＜0.05)。高糖和/或高脂干预6h时，SelS表达均增加，其中高糖联合高脂组及高脂组较高糖组增加更显著(P＜0.05)，提示SelS可能与高糖和/或高脂诱导的HAECs自噬及Akt/mTOR通路有关。
过表达SelS能改善高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤：显著增加eNOS表达水平，显著降低ET-1、ICAM-1表达水平(P＜0.05)；抑制HAECs自噬：显著减少指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集，减少LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平，增加P62蛋白表达(P＜0.05)。而低表达SelS时，与过表达SelS结果正好相反，使高糖和/或高脂诱导的HAECs损伤进一步加重：显著减少eNOS表达，增加ET-1、ICAM-1表达水平(P＜0.05)；激活HAECs自噬：增加指示自噬小体的mRFP-GFP-LC3荧光点状聚集，增加LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表达，减少P62蛋白表达(P＜0.05)。过表达SelS时，高糖和/或高脂诱导HAECs表达p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值增加(P＜0.05)，提示Akt/mTOR通路被激活；低表达SelS时，高糖或高脂诱导HAECs表达p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值减少(P＜0.05)，提示Akt/mTOR通路被抑制。
结论：
1.高糖和/或高脂以时间依赖的趋势损伤内皮细胞，同时伴有自噬水平和SelS蛋白表达水平的变化，提示SelS与高糖和/高脂导致的内皮损伤及自噬有关。
2.高糖和/或高脂诱导HAEC自噬呈先增加后减少的动态变化，p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值显著减少，SelS表达增加，提示SelS与高糖和/或高脂诱导的内皮细胞损伤及Akt/mTOR通路有关。
3.高表达SelS时，Akt/mTOR通路激活，HAEC自噬受抑制，高糖和/或高脂诱导的内皮细胞损伤改善；而低表达SelS与此结果相反。表明SelS可能通过调节Akt/mTOR自噬通路保护内皮免受高糖和/或高脂的损伤。