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由于肉鸡出栏日龄缩短,孵化期在肉鸡整个生命周期的占比相应增加,胚胎时期的营养状态对于调控全期的组织器官生长发育愈发重要。同时,发生于胚胎发育早期的表观遗传重编程过程,使得表观基因组对环境的敏感性增加,此时鸡胚营养状态的改变,可通过调控代谢及基因表达,从而诱发表型变化。通过胚蛋给养技术添加外源营养物质以期调控禽类的生长和发育,并阐明其调控胚胎发育的分子机制,逐渐成为营养学研究的趋势。实验室前期研究发现,鸡胚给养维生素C能够改善肉鸡免疫应答并提高抗应激能力,免疫器官的发育和成熟是免疫功能执行的基础,而维生素C对于免疫功能的最终调节可能与调控出雏前后免疫器官的代谢和发育有关。本试验借助胚蛋给养技术及原代脾脏细胞培养技术,分别在肉鸡生长的胚期阶段、成年阶段和体外细胞水平探究维生素C调节脾脏发育及成熟的潜在机制。试验一鸡胚给养维生素C调控肉鸡脾脏发育的潜在途径试验将120枚AA肉鸡商品代受精蛋随机分为两个处理,于鸡胚孵化第11天进行胚蛋注射。注射程序如下:1)对照组(CON)注射生理盐水,注射体积0.1 m L,注射部位为卵黄囊;2)试验组(VC)注射等体积的维生素C溶液,浓度为30 mg/m L。至胚蛋孵化第19天,每处理选取发育良好的胚蛋20枚并采集脾脏组织,分别将脾脏组织混合后,提取RNA进行转录组测序。结果显示:1)差异表达基因的GO功能富集分析发现,鸡胚给养维生素C调控胚期脾脏发育的磷代谢、核苷酸代谢及生物合成、嘌呤核苷酸代谢和多细胞生物繁殖等生物过程;2)差异表达基因的KEGG通路富集分析发现,胚期维生素C注射参与调控嘌呤代谢通路、脂肪酸代谢及降解通路、丙酸盐代谢通路及血管平滑肌收缩通路等。其中,嘌呤代谢通路的富集水平最显著,其次是脂肪酸代谢通路。本试验结果表明,鸡胚给养维生素C可广泛调控胚期脾脏发育的多种代谢及生物过程,综合GO和KEGG分析结果提示,嘌呤核苷酸代谢过程可能作为维生素C调节脾脏发育的潜在途径。试验二鸡胚给养维生素C对肉鸡脾脏核苷酸代谢及细胞增殖凋亡的影响试验将240枚AA肉鸡商品代受精蛋随机分为两个处理,于孵化第11天进行胚蛋注射,对照组与维生素C组分别注射生理盐水和浓度为30 mg/m L的维生素C溶液,注射体积0.1 m L,注射部位为卵黄囊。将胚蛋继续孵化至出壳,出壳后各处理选取健康并发育良好的雏鸡,随机分为6个重复,每个重复10只鸡,试验期42天。于试验期第21和42 d采集肉鸡脾脏、胸腺和法式囊组织样品。结果表明:1)胚期注射维生素C显著提高了第21 d肉鸡脾脏的维生素C含量(P<0.05),对42 d脾脏的维生素C含量以及胸腺和法式囊中维生素C含量无显著影响;2)维生素C组显著降低了42 d肉鸡脾脏腺苷脱氨酶(ADA)的m RNA表达量(P<0.05),对21和42 d脾脏腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)的m RNA表达量无显著影响;3)维生素C组显著降低了21d肉鸡脾脏AKT-1、PCNA以及42 d Bcl-2的m RNA表达量,同时显著上调了Caspase-9基因相对表达量(P<0.05)。本试验结果表明:胚期注射维生素C能够特异性提高肉鸡成年阶段脾脏的维生素C含量,并维持对嘌呤核苷酸代谢途径的调控效应至发育后期;同时一定程度上促进脾脏细胞凋亡,进而调节脾脏成熟。试验三体外探究维生素C对脾细胞代谢及发育的影响试验采用21日龄健康肉鸡,通过鸡淋巴细胞分离液纯化法分离得到鸡原代脾脏淋巴细胞。试验设对照组(CON)和不同维生素C浓度处理组,维生素C处理浓度如下:250 mg/L(VC-1),500 mg/L(VC-2),1000 mg/L(VC-3),2000 mg/L(VC-4),分别培养24、48 h。处理结束后,收集细胞并提取总RNA,用RT-q PCR法检测基因相对表达量,MTT法检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果表明:1)处理24 h时,脾脏细胞增殖随着维生素C剂量的增加以VC-2组处理浓度为拐点,呈现先增强后抑制的趋势;处理48 h时,脾脏细胞增殖随着维生素C剂量增加而被抑制;2)VC-3和VC-4组显著上调了APRT、Caspase-9、Cytc基因相对表达量(P<0.05),并显著下调了Caspase-3基因相对表达量(P<0.05),且维生素C的调节作用随着处理时间延长而增强;3)维生素C处理显著上调了脾脏细胞细胞凋亡率(P<0.05);4)嘌呤核苷酸代谢相关的APRT表达与凋亡相关基因表达呈现一定正相关。本试验结果表明:维生素C调控脾脏细胞增殖与凋亡呈现时间和浓度依赖性的趋势,1000 mg/L及以上剂量的维生素C处理能够促进脾脏细胞凋亡;且APRT表达与细胞凋亡相关基因Caspase-9、Cytc及Caspase-3表达呈一定正相关,即凋亡过程的发生可能与APRT所催化的反应途径有关。综上所述,鸡胚给养维生素C能够广泛影响胚期阶段脾脏的代谢过程,并提示嘌呤核苷酸代谢过程可能作为维生素C调节脾脏发育的潜在途径。在成年阶段肉鸡脾脏中的研究发现胚期注射的影响能够持续到脾脏发育后期;维生素C可能通过一定程度上的促进脾脏细胞凋亡,从而调控脾脏成熟,且维生素C的促凋亡作用可能与APRT介导的嘌呤核苷酸代谢途径有关。