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研究背景:流行性病毒感冒是严重危害人类健康的传染性疾病。根据流感病毒核蛋白和基质蛋白抗原性的不同,可以将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四种亚型,其中甲型流感病毒最容易发生变异。甲型流感病毒新亚型的出现或旧亚型的重现往往会导致流感大流行。例如,1918年西班牙爆发的甲型流感病毒H1N1病毒造成全世界约5亿人感染,约有5千万到1亿人死亡。甚至在100年后的今天,流感病毒仍然在这个星球上肆虐。据世界卫生组织(WHO)最新报道,在全球范围内,流感流行每年造成约300万至500万严重病例,约29万至65万例与呼吸道疾病相关的死亡。显然,这已造成了严重的社会和经济问题。流感的防治,尤其是药物治疗,已是迫在眉睫。迄今为止,临床应用的抗流感药物主要有神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道抑制剂,但抗流感病毒治疗耐药性病例增多、药物毒副作用等问题一直困扰着现有化学药物的发展和应用[1]。因此,人们迫切地希望寻找结构新颖、生物活性独特、毒性低的新型抗流感病毒药物。由于陆地资源的过度开采,人们对海洋资源的开发也越来越重视。海洋是一个开放且复杂的生态系统,蕴藏着极其丰富的天然产物,海洋生物圈是潜在的新药来源宝库这一理念已经成为共识。由于海洋具有高压、高盐、低氧和无光照的生态环境,使得海洋生物产生了与陆生生物不同的次生代谢产物,已成为研究人员探求活性先导化合物的重点。据不完全统计,到目前为止科学家已经从海洋生物中分离出3万余种单体化合物,其中50%以上具有较好的生物活性。在已发现的化合物中,超过0.1%的代谢产物具有化学结构新颖,活性显著的特点,这为发现新的抗流感病毒药物提供了更多的可能。研究目的:本课题拟对海洋来真菌Diaporthe sp.SCSIO41011与Cochliobolus lunatus与SCS1O41401的次级代谢产物进行抗病毒活性筛选,获得2-3个较高活性的单体化合物。对其中1个具有较好抗流感病毒活性的化合物Spirostaphylotrichin X进行作用机制研究,明确其作用靶点,旨在阐明Spirostaphylotrichin X抑制流感病毒复制的机制,为研发新型的抗流感病毒药物提供科学依据。研究方法:1.采用MTT实验来评价红树林真菌Diaporthesp.SCSIO 41011与海生真菌Cochlioboluslunatus.SCSIO41401的次级代谢产物的细胞毒性和不同亚型流感病毒的体外抗病毒活性筛选。2.采用蛋白质免疫印迹、间接免疫荧光和实时荧光定量PCR的方法检测Spirostaphylotrichin X对甲型流感病毒复制的影响。3.采用假病毒抑制实验、血凝抑制实验、神经氨酸酶抑制实验、time-of-addition和病毒RNA聚合酶抑制实验研究Spirostaphylotrichin X对流感病毒复制周期不同阶段的阻断作用。4.采用均相时间分辨荧光(HTRF)实验、荧光偏振(FP)实验、表面等离子体共振(SPR)实验以及分子对接实验确认Spirostaphylotrichin X的作用靶点。实验结果:1.从2种海洋真菌的33种次级代谢产物中筛选出5种具有抗甲型流感病毒活性的化合物,分别为Dsp.14,Dsp.15,Dsp.26,5-chloroisorotiorin 和Spirostaphylotrichin X。2.SpirostaphylotrichinX对不同亚型的甲型流感病毒均具有抑制作用,包括奥司他韦耐药株和临床分离株,其IC50值在1.2-5.5 μM之间。3.Spirostaphylotrichin X对甲型流感病毒的包膜蛋白血凝素和神经氨酸酶均无抑制作用。4.SpirostaphylotrichinX只有在治疗模式下可以发挥抑制病毒作用,抗病毒药效作用于流感病毒感染的早期阶段。5.Spirostaphylotrichin X能显著性的降低流感病毒RNA聚合酶的活性。6.Spirostaphylotrichin X的作用靶点为RNA聚合酶PB2亚基,能与PB2cap蛋白特异性结合,抑制流感病毒转录的起始阶段。7.Spirostaphylotrichin X能够与PB2cap蛋白上Arg 355,Asn 429,Met 431,Phe325及Lys339结合。研究结论:1.SpirostaphylotrichinX具有抗甲型流感病毒的作用,且能抑制多种甲型流感病毒的复制,包括奥司他韦耐药株(A/PR/8/34(H1N1)with NA-H274Y)和临床分离株influenza A 690(H3)。2.Spirostaphylotrichin X在流感病毒感染细胞的早期阶段发挥抗病毒作用。3.SpirostaphylotrichinX能够与流感病毒PB2cap蛋白结合,抑制流感病毒的复制。4.Spirostaphylotrichin X能够与PB2cap蛋白功能区的氨基酸残基位点相互作用,且这些位点具有高度保守性。