低温下心肌细胞骨架微管的变化与冷缺血损伤相关性的研究目的心脏移植是公认的治疗终末期心脏病唯一有效的手段,但由于供体心脏的低温安全保存期目前仅有4～6小时,极大地限制了心脏移植的开展。因此,如何有效地延长离体心脏安全保存期是心脏移植中亟待解决的问题,而阐明心肌冷缺血损伤的病理生理学机制,寻找更有效的抗心肌冷缺血/再灌注损伤措施则是一个重大的研究课题。细胞骨架是细胞内重要的保守结构,在维持细胞内外的有序性空间结构和细胞的生命活动中起重要作用。由于细胞骨架的完整性与温度有密切关系,因此,研究低温环境下心肌细胞骨架的变化对细胞结构和功能的影响十分必要。该课题依据近年来国内外在细胞骨架研究方面所取得的新进展,从细胞的结构与功能关系的角度出发,探讨低温环境下心肌细胞骨架微管与心肌冷缺血损伤的关系,以及将保护细胞骨架作为新的心肌保护措施的可能性。该研究对于解决器官移植中供体心脏的安全保存难题有重要意义。本研究分三部分进行。第一部分进行成年大鼠离体心脏低温保存和复温再灌注实验,在保存液中加入微管稳定剂和解聚剂,经过6小时低温保存后,复温再灌注,检测冠脉漏出液中心肌酶的含量,同时进行形态学观察,探讨微管的解聚与稳定对离体心脏低温保存的影响。第二部分,进行成年大鼠分离心肌细胞低温保存实验,分别利用组化免疫荧光和生物化学比色分析的方法,观察心肌细胞经历低温保存后微管的变化和心肌酶释放率以及心肌细胞存活率,探讨微管的改变与心肌细胞损伤之间的关系。第三部分,观察微管稳定剂对低温保存和复温再灌注大鼠心肌细胞凋亡发生的影响;进一步说明细胞骨架与心肌细胞凋亡发生的关系。实验方法1、离体鼠心灌流和低温保存SD大鼠随机分成3组,包括对照组（HTK液保存）,紫杉酚组(HTK液中含紫杉酚,浓度为10^-6M)和秋水仙素组(HTK液中含秋水仙素,浓度为10^-6M)。动物麻醉,气管插管,呼吸机辅助呼吸,主动脉插入灌注管并迅速取下心脏,在37℃恒温条件下利用离体鼠心Langendorff灌注模式装置,进行常规逆行恒压有氧灌注,待心肌血流动力学稳定后,留取冠脉漏出液,改为经主动脉灌注不同的心肌保存液,心脏停跳,放入4℃不同保存液中保存6h,复温再灌时留取冠脉漏出液,并切取心肌组织做光镜和电镜观察。2、成年SD大鼠心肌细胞分离灌流方式同前,但是分别用有钙台氏液和无钙台氏液灌流。再用含Ⅱ型胶原酶和小牛血清白蛋白（BSA）的无钙台氏液灌注并消化心脏。然后再用KB液冲洗残酶。灌流过程持续充氧饱和。剪碎心室部分,轻轻振荡,使细胞分离,然后滤过、低速离心、倾出上清液（含部分死亡破碎的细胞）,即得到实验用细胞,换KB液保存。3、分离心肌细胞处理方法将每一次分离得到的心肌细胞随机分为对照组和实验组,各组设4℃保存0.5h和3h。实验组添加紫杉酚(最终浓度为10^-6M)。分别在相应的保存时间点取出,吸取细胞悬液涂片,进行微管免疫荧光检测和台盼蓝染色,余下悬液经过高速离心后,移出上清液,做LDH活力分析,沉淀细胞用同体积的含1%Triton X-100（Sigma）的PBS 37℃下孵育30min后做LDH活力分析。媒介中（释放出的）和细胞溶解（保留的）的LDH活力,通过分光光度计和试剂盒检测出来。LDH释放以占总LDH活力（释放+保留）的百分比表示。4、免疫荧光染色方法分离的单细胞涂片,凉干,然后在冷（-20℃）甲醇中固定3min,再用冷丙酮浸湿三次。放入冰箱,4℃保存,第二日做微管免疫荧光检测。荧光显微镜下观察拍照,图像经过Image-Pro Plus图象分析软件（Media cybernetics公司）分析检测。5、台盼蓝染色涂片后用0.1%台盼蓝滴染,高倍镜下（×400）计数200个细胞,计算拒染的杆形细胞所占的比率。6、凋亡检测采用Roche公司检测试剂盒,运用原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的荧光素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法（TUNEL）进行凋亡细胞检测,结果判定;TUNEL阳性细胞核呈现紫色或紫黑色,阴性对照和正常细胞核呈淡粉色。7、漏出心肌酶检测采用试剂盒对离体心脏保存前和再灌注后的冠脉漏出液以及分离心肌细胞低温保存后释放出的和细胞内残留的心肌酶进行生物化学比色分析。8、光镜和电镜观察对心脏低温保存和复温再灌注后的心肌进行常规形态和凋亡观察。实验结果1、分离的成年大鼠心肌细胞低温下微管的改变低温保存30min后,细胞微管结构即遭到解聚,表现为免疫荧光减弱,微管结构的连续性开始丧失,变得粗糙,不光滑,微管结构不清晰。对照组（单纯KB液保存）变化明显突出,保存05.h后微管平均光密度为20.20±1.49,3h后为12.46±1.66;而实验组（含紫杉酚）变化轻于对照组,保存0.5h后为25.49±1.52,3h后为20.41±1.52,在相同保存时间点实验组与对照组比较P＜0.05。随着保存时间延长,两组微管荧光逐渐减弱,微管网络进行性丢失。2、分离的成年大鼠心肌细胞低温下LDH释放率乳酸脱氢酶（LDH）从保存的心肌细胞中释放的情况,在经过不同保存时间后被检测。实验结果表明实验组（保存液含微管稳定剂）低温保存0.5h后LDH释放率为51.88%±1.06,3h后为58.87%±1.09,明显少于对照组（保存液不含微管稳定剂）;对照组低温保存0.5h后LDH释放率为56.44%±1.45,3h后为65.68%±1.37。在相同保存时间点实验组与对照组比较P＜0.05。3、分离的成年大鼠心肌细胞低温下心肌细胞存活率细胞存活率是通过台盼蓝染色的方法观测到的,实验结果表明在低温保存3h后两组差距明显,对照组细胞存活率为27.2%±5.05,实验组为38.80%±2.66。实验组与对照组比较P＜0.05。4、成年大鼠心脏低温保存复温再灌注后心肌光镜下改变对照组（HTK保存液）心内膜下、心肌层、心外膜下均有水肿,表现为细胞间隙增宽、血管周围间隙增大,心肌细胞明显变细、皱缩,但心肌细胞边缘整齐。紫杉酚组与对照组比较,水肿明显减轻,心肌细胞周围间隙变小,心肌细胞边缘整齐、形态基本正常;秋水仙素组心壁各层明显水肿,心肌细胞边缘不整,细胞周围间隙较大,部分心肌细胞呈结节状溶解。5、成年大鼠心脏低温保存复温再灌注后心肌超微结构改变对照组线粒体肿胀,嵴结构部分溶解,肌质管扩张,但肌节结构仍然清楚,肌丝结构清晰、无溶解。紫杉酚组无线粒体肿胀,嵴结构正常,肌原纤维排列整齐,肌节各带清晰可见,肌质管扩张不明显。秋水仙素组肌原纤维结构紊乱,肌节各带结构不完整,线粒体明显扩张,线粒体嵴溶解、空化现象严重,肌质管明显扩张,肌膜肿胀,呈指状突起。6、成年大鼠心脏低温保存复温再灌注后冠脉漏出液中心肌酶的检测保存后复灌4min时各组心肌酶（LDH,GOT,CK）漏出量以秋水仙素组最多,紫杉酚组最少,对照组次之,三组间差异显著。7、成年大鼠心脏低温保存和复温再灌注后心肌细胞凋亡的发生在各对照组和实验组内,电镜下观察都可见到心肌细胞凋亡的核像改变,部分核的染色质向核膜集聚,部分核的染色质积聚成块,不均匀分布。原位末端标记（TUNEL法）的切片镜下观察可见,发生凋亡的细胞主要是心肌细胞,少数为浸润的淋巴细胞和血管内皮细胞。组内比较和组间比较,结果;（1）在对照组和实验组内,离体鼠心低温保存时间与凋亡发生指数成正比,低温保存时间越长凋亡细胞越多（P＜0.01）,6h鼠心低温保存的心肌凋亡细胞数量明显多于4h低温保存的心肌凋亡细胞数量;（2）在对照组和实验组内,低温保存时间越长,对复温再灌注后的凋亡细胞发生影响也越大,凋亡细胞数量越多,即6h低温保存复温再灌注后的凋亡细胞数量明显多于4h低温保存复温再灌注后的心肌凋亡细胞数量（P＜0.01）;（3）在实验组和对照组内,复温再灌注后的凋亡细胞指数明显高于再灌注前的单纯低温保存的凋亡细胞指数（P＜0.01）,可见复温再灌注加重了细胞损伤,增加了心肌细胞凋亡数量;（4）实验组与对照组相比,在各个保存和再灌注时间点上,凋亡指数都明显低于对照组（P＜0.01）,含有紫杉酚(10^-6M)的供心保存液THK液具有明显的低温供心保护作用。结论1、4℃低温下,分离心肌细胞保存0.5h心肌细胞微管即发生解聚,保存3h微管解聚加重,解聚程度与低温缺血时间成正比。紫杉酚可以稳定微管,减轻微管的解聚。2、4℃低温下离体心脏心肌细胞损伤、心肌酶（LDH,GOT,CK）释放,与微管解聚成正相关,稳定微管可以减轻心肌细胞释放LDH、GOT和CK。3、4℃低温下可以导致离体心脏线粒体结构受损,微管解聚剂可以加重线粒体损害,微管稳定剂可以减轻这种损害。4、4℃低温保存可以引起离体心脏心肌细胞凋亡发生,复温再灌注能加重凋亡发生,低温保存时间越长,复温再灌注后心肌细胞凋亡发生的越多。微管稳定剂可以减轻低温保存下心肌细胞凋亡的发生。