神经元纤维缠结(NFT)和老年斑(SP)是阿尔茨海默病(AD)的两个典型的病理改变，本实验研究的目标是建立具有老年斑和神经元纤维缠结两种病理改变的转基因小鼠，为AD的病理机制研究和药物开发提供理想的动物模型。　　 本实验室的前期实验是将带有小鼠特异性的神经元启动子Thy-1和含有P301L突变的人最长Tau蛋白的异构体通过雄原核显微注射法，转入FVB小鼠受精卵中建立Tau转基因小鼠模型；检测Tau转基因小鼠脑内具有外源性Tau蛋白表达，将含P301L突变的Tau转基因鼠传至第5代；并通过了行为学检测发现Tau转基因小鼠在6月时具有行为学改变，9月龄时发现海马和皮层出现NFT。　　 本课题是在前期实验的基础上，将自行建立的表达NFT的Tau转基因小鼠与从Jackson实验室引种的表达Aβ蛋白的APP/PS1转基因小鼠杂交，应用PCR筛选含有外源基因的子代鼠；采用RT-PCR和Western-blot检测外源基因的转录和表达；通过行为学实验和病理学研究其生物学特性。　　 杂交小鼠已繁殖两代。F1代，共16窝，生仔97只。经PCR检测出现4种不同转基因小鼠类型，分别为：①含有Tau、APP、PS1的Tau/APP/PS1三重转基因小鼠，阳性率为42.26％；②含有APP和PS1基因的APP/PS1转基因小鼠，阳性率为5.15％；③含有Tau基因的Tau转基因小鼠，阳性率为49.48％；④无外源基因的野生型小鼠有3.12％。将Tau/APP/PS1三重转基因阳性小鼠进行种内繁殖得到第F2代，共62只，其中Tau/APP/PS1三转重转基因小鼠阳性率为54.83％，APP/PS1转基小鼠阳性率为12.9％，Tau转基因小鼠阳性率为16.15％，野生型小鼠16.12％。F2代Tau/APP/PS1三重转基因小鼠阳性率高于F1代，结果有显著性的差异，以上实验结果提示杂交繁殖可得到Tau/APP/PS1三重转基因小鼠，并已传至F2代。Tau基因和APP/PS1基因不在同一染色体上。　　 用RT-PCR、western-blot、银染、免疫组化和Morris水迷宫实验对杂交所得到的野生型小鼠(Wt)、Tau转基因小鼠(Tau)、APP/PS1转基因小鼠(APP/PS1)和Tau/APP/PS1三重转基因小鼠(Tau/APP/PS1)进行了生物学研究。　　 RT-PCR实验结果发现野生型小鼠没有外源基因的转录，Tau转基因小鼠有Tau基因转录，APP/PS1小鼠有APP和PS1基因转录。Tau/APP/PS1则有APP、PS1和Tau基因的转录。提示杂交所得转基因小鼠的外源基因可以在大脑正常转录。　　 Western-Blot实验检测小鼠大脑海马和皮层区外源Tau蛋白和Aβ蛋白的表达。结果发现3、6、9月龄Tau转基因小鼠和Tau/APP/PS1转基因小鼠均有Tau蛋白表达，APP/PS1转基因小鼠及Tau/APP/PS1三重转基因小鼠有Aβ蛋白的表达。3月龄的APP/PS1转基因小鼠及Tau/APP/PS1三重转基因小鼠的Aβ蛋白表达较低。提示Aβ蛋白的蓄积需要较长时间。　　 选取行为学改变较为明显的9月龄Tau转基因小鼠、APP/PS1转基因小鼠和Tau/APP/PS1三重转基因小鼠的海马和皮层，应用Western-blot进行Tau蛋白和Aβ蛋白检测，结果发现Tau/APP/PS1三重转基因小鼠海马区的Aβ蛋白表达量高出APP/PS1转基因小鼠34.7％，P＜0.05，有统计学差异。提示在Tau/APP/PS1三重转基因小鼠中外源Tau蛋白的表达可能影响外源Aβ蛋白的含量。　　 Western-Blot检测9月龄的Tau/APP/PS1三重转基因小鼠大脑海马区、前额叶皮层、顶叶皮层和颢叶皮层的Tau蛋白和Aβ蛋白表达。结果发现Aβ蛋白在海马、前额叶皮层、顶叶皮层和颢叶皮层均有表达，前额叶皮层和项叶皮层Aβ蛋白含量与海马区比较高出71.36％和84.21％，P＜0.01，有统计学差异。Tau蛋白在海马、前额叶皮层、顶叶皮层和颞叶皮层均有表达，海马区Tau蛋白含量高出前额叶皮层24.8％、项叶皮层24.16％、颞叶皮层25.96％。P＜0.05，有统计学差异，以上结果提示可能海马区是发生神经纤维缠结较早的区域，额叶皮层和顶叶皮层的可能较早发生Aβ淀粉样沉积。　　 Bielschowsky银染法对小鼠进行银染色，结果发现在9月龄时Tau转基因小鼠和Tau/APP/PS1三转基因小鼠的皮层和海马部位可观察到火焰状或球形的神经元纤维缠结。提示在9月龄时Tau/APP/PS1三转基因小鼠海马和皮层区表达神经元纤维缠结。　　 ABC免疫组织化学法观察各转基因小鼠Aβ蛋白沉积所形成的老年斑，结果发现6月龄时在Tau/APP/PS1三重转基因小鼠皮层区及APP/PS1转基因小鼠海马区和皮层区出现红棕色斑块即Aβ蛋白沉积形成的老年斑，9月龄时Tau/APP/PS1三重转基因小鼠和APP/PS1转基因小鼠在海马区和皮层区均观察到老年斑，而野生型小鼠及Tau转基因小鼠无此病理改变。提示Tau/APP/PS1三重转基因小鼠Aβ沉积呈渐进性，皮层区先出现由Aβ沉积形成的老年斑。　　 用Morris水迷宫进行定位航行实验和空间探索实验测定小鼠的空间学习记忆能力。6月龄时Tau/APP/PS1三重转基因小鼠在训练的第1、2、3天时分别为73.49±15.94(s)、59.16±14.96(s)、47.92±15.76(s)，与Wt小鼠相比逃逸潜伏期延长，有统计学差异，P＜0.05。9月龄时在第2、3、4、5天时逃逸潜伏期分别为78.45±21.33、68.43±14.58、54.35±14.58、58.43±13.26与Wt组比较潜伏期延长。结果提示Tau/APP/PS1三重转基因小鼠在6月龄时学习记忆获得能力降低，9月龄时记忆损伤程度加深。空间探索实验结果发现6月龄时Tau转基因小鼠和Tau/APP/PS1三重转基因小鼠穿越平台次数为1.8±0.58、2.0±0.54，与野生型小鼠相比穿越平台次数减少，P＜0.05，结果有显著性差异，提示从6月龄开始Tau转基因小鼠和Tau/APP/PS1三重转基因小鼠记忆保持能力受损。　　 综上所述，杂交育种得到的Tau/APP/PS1三重转基因小鼠大脑能转录和表达外源基因，6月龄时大脑皮层区开始出现Aβ沉积形成的老年斑，9月龄时出现神经元纤维缠结，并伴有较为明显的学习记忆障碍。截止2010年4月，国内尚无Tau/APP/PS1三重转基因小鼠建立和传代的报道。Tau/APP/PS1三重转基因小鼠具备较全面的病理变化和渐进性的学习记忆障碍，扩大种群后可作为成本低廉购买方便的AD小鼠模型。