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目的:FGF21是一种主要由肝脏分泌的内分泌因子,其主要作用为调节糖脂代谢。动物实验证实FGF21具有降低血糖、抑制胰岛素敏感性、调节异常血脂等生物功效,但其在糖尿病心肌病中的作用机制不明。本论文主要采用小剂量STZ+高脂饮食方法造成小鼠糖尿病心肌病模型,观察FGF21基因缺失对STZ+高脂饲料诱导糖尿病小鼠心肌病变的影响,并在细胞水平上进一步研究FGF21对高唐刺激的H9C2心肌细胞的保护作用。 方法: (1)STZ+高脂饲料造成小鼠糖尿病模型及小鼠体内FGF21的变化 取8只8周龄雄性C57BL/6j野生型(WT)小鼠随机分为两组,其中一组腹腔注射0.2 ml STZ(50 mg/kg),再高脂饲料喂养10周,另一组,腹腔注射相同体积PBS为对照,再普通饲料喂食10周,分别在注射前(0 d)及注射后7,30,60 d固定时间检测两组小鼠的血糖水平,记录小鼠体重变化。注射10周后处死上述两组老鼠,收集其血样及组织。观察STZ+高脂饲料处理后小鼠糖尿病病变状况:使用血糖仪检测随机血糖、H&E染色观察组织形态学变化;同时,采用ELISA方法观察STZ+高脂饲料处理后小鼠血清及肝脏、胰腺、脂肪、心脏组织中FGF21的变化状况,并采用Q-PCR的方法检测小鼠心肌组织中FGF21 mRNA表达的水平变化。 (2) FGF21基因缺失对STZ+高脂饲料诱导的糖尿病心肌病变的影响 取8只8周龄雄性C57BL/6j FGF21基因缺失(FGF21 KO)小鼠随机分成A、B两组,同时取8只相同年龄及背景的C57BL/6j野生型小鼠亦随机分成C、D两组。A、C两组小鼠腹腔注射0.2 ml STZ(50 mg/kg),再高脂饲料喂养10周,C、D两组小鼠腹腔注射相同体积PBS为对照,再普通饲料喂食10周。分别在注射前(0 w)及注射后每周固定时间观察四组小鼠的血糖水平变化并进行葡萄糖耐受实验。注射STZ后饲养10周,处死收集其血样及心肌等组织,分别进行如下处理:1)采用H&E染色观察心肌组织形态学的改变;2)采用Q-PCR的方法检测小鼠心肌组织中炎症相关因子TNF-α,IL-1b;3)采用Sirus染色观察心肌组织纤维化病变状况,同时观察心肌组织中纤维化相关因子ColⅠ,MHC-β mRNA表达水平变化;4)采用免疫组化检测凋亡早期蛋白caspase3活性的变化。 (3) FGF21抗高糖引发的H9C2心肌细胞损伤的分子作用机制研究 ①β-klotho在H9C2细胞株中的表达状况 采用Q-PCRDE方法检测原代脂肪细胞分化的脂肪细胞和H9C2细胞株中β-klotho mRNA表达水平;同时,采用Western blot的方法检测原代脂肪细胞分化的脂肪细胞和H9C2细胞株中β-klotho的蛋白水平。 ②FGF21对高糖刺激H9C2细胞后TGF-β,ROS表达水平影响 首先对细胞进行分组,处理如下:i.含5.5 mM葡萄糖DMEM培养基处理作为对照组;ii.含33 mM葡萄糖浓度的DMEM培养基作为造模组;iii.含33 mM葡萄糖浓度的DMEM培养基合用10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml FGF21作为梯度给药组。培养36 h后收集细胞RNA,采用Q-PCR的方法检测细胞中TGF-β mRNA表达水平,并寻找到FGF21最适作用浓度。其次,采用上述方法,分别用5.5mM葡萄糖DMEM培养基,33mM葡萄糖DMEM培养基及33mM葡萄糖DMEM培养基合用最适浓度FGF21刺激心肌细胞,培养6h后,找到采用流式细胞仪观察细胞内ROS水平。 ③FGF21对高糖刺激H9C2细胞后AMPK、Akt磷酸化水平影响 对细胞进行分组,处理如下:i.含5.5 mM葡萄糖DMEM培养基处理作为对照组;ii.含33 mM葡萄糖浓度的DMEM培养基作为造模组;iii.含33mM葡萄糖浓度的DMEM培养基合用10 ng/ml,50 ng/ml,100 ng/ml FGF21作为梯度给药组。作用6h后收集蛋白,采用Western blot的方法检测p-AMPK、AMPK、p-Akt、Akt蛋白水平。 ④AMPK磷酸化与ROS之间关系探讨 对细胞进行分组,处理如下:i.含5.5 mM葡萄糖DMEM培养基处理作为对照组;ii.含33 mM葡萄糖浓度的DMEM培养基作为造模组;iii.含33mM葡萄糖浓度的DMEM培养基合用最适浓度FGF21作为给药组;iv.含33 mM葡萄糖浓度的DMEM培养基合用最适浓度FGF21作为给药组加入AMPK磷酸化抑制剂Compound C作为处理组,置于细胞培养箱内培养6h后收集细胞,观察细胞内ROS水平。 结果: (1) FGF21在STZ+高脂饲养诱导小鼠的糖尿病病变过程中显著上调 STZ+高脂饲料作用后的WT小鼠的体重持续升高,而PBS+普通饲料处理的WT小鼠则维持不变;在0d,7d,30d,60d检测的随机血糖值也显示 STZ+高腊诱导后小鼠血糖显著升高(p<0.01); IGTT的实验结果显示,糖尿病模型组的糖耐受明显受损(p<0.001);与对照组相比,模型组老鼠的肝脏和脂肪组织增重。心肌组织HE染色结果表明,STZ+高脂饲料诱导后,心肌细胞纹理紊乱。同时,ELISA结果显示,两组小鼠血清中FGF21的蛋白水平也存在差异,STZ+高脂饲料处理后血清FGF21蛋白含量增加。心肌组织中FGF21蛋白含量没有显著性变化,但FGF21主要来源组织如胰腺,脂肪中FGF21蛋白表达水平上调,与对照组相比,存在显著性差异(p<0.05);同时,心肌细胞中FGF21的mRNA表达水平也呈现一致的趋势。 (2) FGF21基因缺失加重STZ+高脂饲养诱导的小鼠糖尿病心肌病的病变状况 与STZ+高脂处理的WT小鼠相比,FGF21 KO小鼠血清中的随机葡萄糖水平明显升高(p<0.05),糖耐受受损;组织形态学结果显示FGF21缺失后心肌细胞紊乱程度加剧;反映炎症的指标TNF-α,IL-1b在FGF21 KO的老鼠中也显著上升(p<0.05);纤维化指标Sirus染色结果显示FGF21基因缺失后胰腺组织胶原蛋白沉积量显著增多,同样,FGF21 KO小鼠心脏组织中的ColⅠ、MHC-β的mRNA表达水平存在显著变化,与对照组相比具有统计学意义(p<0.05)。免疫组化结果显示FGF21基因缺失活化了caspase3的水平。 (3) FGF21通过激活AMPK信号通路抑制高糖对H9C2心肌细胞的损伤 实验结果显示,心肌细胞中能表达β-klotho。与低糖处理的对照组细胞相比,高糖刺激显著上调了纤维化指标TGF-β mRNA水平(p<0.05),而用不同浓度FGF21进行给药后,TGF-β水平下调,尤其在50 ng/ml下调作用最为显著(p<0.05)。同时,H9C2细胞高糖处理后, AMPK磷酸化水平降低,用不同浓度FGF21处理后其磷酸化水平上升,亦是在50ng/mlFGF21处理后作用最为明显(p<0.05)。流式结果显示,50ng/ml的FGF21能有效地逆转高糖诱导的ROS上调的表达(p<0.05)。而合用AMPK磷酸化抑制剂后,ROS的表达又上调(p<0.05)。 结论: (1) FGF21基因缺失能加重STZ+高脂诱导的小鼠糖尿病心肌病的病变。 (2) FGF21通过上调P-AMPK来抑制高糖诱导的ROS产生、减少ROS引发的心肌细胞凋亡,从而达到抵抗高糖环境对心肌细胞损伤的作用;此外,FGF21通过调节TGF-b的表达状况,从而抑制心肌纤维化的病变发展,进而发挥抗糖尿病心肌病的生物学效应。