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类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)首先是在类固醇激素生成组织中发现的，对类固醇激素合成具有重要限速作用。StAR可介导胆固醇由线粒体外膜转到线粒体内膜，之后胆固醇在线粒体内细胞色素氧化酶的作用下转化为极性更强、更易流出细胞的氧化固醇。因此StAR有助于胆固醇流出，可能参与了动脉粥样硬化中胆固醇逆向转运过程。随着研究的深入，人们发现StAR除了存在于类固醇激素生成组织外，还表达于其他组织中，其中研究最多的是肝脏。在肝细胞中，StAR同样具有将胆固醇由线粒体外膜转入内膜的作用，是胆汁酸酸性合成途径的限速步骤。更有意义的是在这个过程中所产生的调节性氧化固醇(oxysterol)，其对维持血浆胆固醇代谢平衡有重要作用，可通过核内固醇类受体调节维持胆固醇代谢平衡关键基因的表达，以达到预防和治疗诸如动脉粥样硬化等与脂质代谢紊乱相关疾病的目的。脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化发生的重要发病环节，而血管内皮细胞则是其发生发展的始动环节。维持胆固醇代谢平衡是预防动脉粥样硬化发生的有效手段。如果血管内皮细胞可将过多的胆固醇等脂类物质由细胞内排出，可阻止过多的脂质进一步向内皮下沉积，进而阻止或减缓动脉粥样硬化的发生和发展。因此，本文研究StAR在体外培养的血管内皮细胞胆固醇代谢中的作用，并利用apoE基因敲除小鼠复制动脉粥样硬化模型在体内研究StAR在小鼠中的表达及意义，从而为动脉粥样硬化的防治提供新的理论基础和实验依据。我们的实验主要分以下四部分：第一部分：建立大鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养方法，用血管内皮细胞生物学功能基因芯片研究原代培养的大鼠心肌微血管内皮细胞特征，为研究心血管疾病奠定基础。在本室前期工作的基础上，利用植块法培养大鼠心肌微血管内皮细胞；利用倒置显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察培养细胞的形态学特征；利用免疫细胞化学方法显示血管内皮细胞特异性表面标志；用细胞计数方法绘制细胞生长曲线；用血管内皮细胞生物学功能基因芯片研究细胞基因表达谱，并比较原代细胞和传代细胞基因表达谱的变化。结果显示：利用植块法培养的大鼠心肌微血管内皮细胞具备多种典型微血管内皮细胞(microvascularendothelial cell，MVEC)特征：细胞呈多边形或梭形并呈铺路石样生长；存在管腔样结构(tube-like structure，TLS)和毛细血管网络，细胞表面有丰富的微绒毛：CD34、CD31、CD105、vW因子和Tie-2阳性；多种与正常血管功能密切相关的基因不同程度表达，前2代细胞特征稳定。以上结果表明，用植块法培养的大鼠心肌微血管内皮细胞，具备微血管内皮细胞的特征，原代和第2代培养细胞特征稳定，可用于心血管疾病的基础与临床研究。比较原代及多次传代细胞基因表达谱的变化，发现原代培养的心肌微血管内皮细胞在多次传代后失去血管内皮细胞的特征，不再适合作为血管内皮细胞使用。第二部分：研究血管内皮细胞中StAR的表达及脂类物质对其的调节，为进一步阐明StAR在血管内皮细胞中的作用奠定基础。通过免疫化学方法研究血管内皮细胞中StAR的表达和定位，利用实时定量RT-PCR、Western blot方法观察游离胆固醇(cholesterol，CHO)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)及25-羟化胆固醇(25-hydroxycholesterol，25-OH)三种脂类物质对bEnd．3细胞中StAR mRNA及蛋白表达的调节。结果首次发现在原代培养的大鼠心肌微血管内皮细胞(rat myocardial microvascualr endothelial cell，RMMVEC)、bEnd．3细胞、人主动脉内膜及人结缔组织小静脉内皮中均有StAR的表达，并主要定位于胞浆中。三种脂类物质对bEnd．3细胞中StAR mRNA及蛋白的影响存在明显的时间和剂量相关性。mRNA结果显示：加入10μml CHO 4小时后，StAR mRNA达最高水平(与对照组相比，P＜0.05)，之后逐渐降低，在24小时回到基础水平；加入15μg／ml LDL后，StAR mRNA也在4小时达到高峰(与对照组相比，P＜0.05)，之后随着时间延长逐渐降低；而加入10μml 25-OH则在12小时达到最高(与对照组相比，P＜0.01)。在剂量依赖实验中，CHO、LDL以及25-OH作用最强浓度分别为10μg／ml(与对照组相比，P＜0.05)、15μg／ml(与对照组相比，P＜0.01)和10μg／ml(与对照组相比，P＜0.05)。蛋白检测结果显示：加入10μg／mlCHO 8小时后，StAR蛋白达最高水平(与对照组相比，P＜0.05)，之后逐渐降低；加入15μg／ml LDL后，StAR蛋白在24小时达到高峰(与对照组相比，P＜0.01)；而加入10μg／ml 25-OH时在4小时达到最高(与对照组相比，P＜0.05)。在剂量依赖实验中，CHO、LDL以及25-OH作用最强浓度分别为10μg／ml(与对照组相比，P＜0.05)、15μg／ml(与对照组相比，P＜0.01)和10μg／ml(与对照组相比，P＜0.01)。以上结果表明，RMMVEC、bEnd．3细胞、人主动脉内膜及人结缔组织小静脉内皮中均有StAR的表达，并主要定位于胞浆中；CHO、LDL和25-OH可上调StAR在bEnd．3细胞中的表达，并呈时间和剂量依赖性。第三部分：在bEnd．3细胞中利用腺病毒载体过表达StAR，研究StAR对血管内皮细胞中胆固醇逆向转运蛋白的影响。通过实时定量RT-PCR及Western blot方法检测细胞中胆固醇逆向转运蛋白——ATP结合盒转运体A1及G1(ATP-binding cassette transporter A1／G1，ABCA1／ABCG1)mRNA及蛋白表达的变化，观察过表达StAR后对血管内皮细胞中胆固醇排出的影响。结果显示：利用腺病毒表达载体可有效感染bEnd．3细胞，感染效率达96％以上，实时定量RT-PCR及Western blot的方法证实bEnd．3细胞中有StAR基因及蛋白的过表达。用含StAR全长cDNA的腺病毒感染bEnd．3细胞48小时后，细胞中胆固醇逆向转运蛋白ABCAlmRNA是对照组1.5倍(与不加病毒对照组及空病毒载体组相比，P＜0.05)，其蛋白表达水平是对照组的3倍(其中与不加病毒对照组相比P＜0.01，与空病毒载体组相比P＜0.05)。同时ABCG1 mRNA表达升高，是对照组的1.8倍(与不加病毒对照组及空病毒载体组相比P＜0.01)，蛋白水平表达也升高，是对照组的1.9倍(与不加病毒对照组及空病毒载体组相比P＜0.01)。结果表明，在血管内皮细胞中过表达StAR可促进胆固醇逆向转运蛋白ABCA1及ABCG1基因及蛋白表达增高，可通过增加血管内皮细胞中胆固醇的逆向转运，来减少内皮细胞中胆固醇的聚集。第四部分：研究StAR在apoE基因敲除小鼠中的表达及意义，并观察血脂及年龄对其影响，为进一步探讨脂质代谢紊乱在动脉粥样硬化中的作用奠定基础。利用实时定量RT-PCR及Western blot方法观察不同年龄、性别小鼠肝脏中StAR mRNA及蛋白表达的变化，利用血脂检测试剂盒检测血脂水平。结果显示：在C57BL／6J小鼠中，随年龄增长血脂含量无明显变化：StAR mRNA及蛋白表达在1月龄达到最高，但无统计学意义。在apoE基因敲除小鼠，随年龄增长血脂逐渐升高，尤以低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)增高为显著(其中3月龄及5月龄vs．1月龄P＜0.01，5月龄vs．3月龄P＜0.01)；StAR mRNA及蛋白表达呈现先增高后降低，1月龄较新生小鼠表达增高(与新生鼠比较P＜0.05)，在3月龄中表达最高(与新生鼠比较P＜0.01)，到5月龄时表达较3月龄小鼠降低(与3月龄小鼠比较P＜0.01)。与C57BL／6J小鼠相比，apoE基因敲除小鼠血脂明显增高(P＜0.01)，肝脏中StAR mRNA表达明显高于对应的C57BL／6J小鼠(其中新生与1月龄小鼠P＜0.01，3月龄及5月龄小鼠P＜0.05)，而StAR蛋白在2种小鼠中表达无明显差异。结果显示StAR在体内的表达与年龄及血脂有一定的联系。综上所述，本研究结果提示：本室用植块法培养的大鼠心肌微血管内皮细胞，具备微血管内皮细胞的特征，原代和第2代培养细胞特征稳定；在RMMVEC、bEnd．3细胞、人主动脉内膜及人结缔组织小静脉内皮中均有StAR的表达，并主要定位于胞浆中；CHO、LDL和25-OH可上调StAR在bEnd．3细胞中的表达，并呈时间和剂量依赖关系；StAR可促进血管内皮细胞中胆固醇逆向转运蛋白ABCA1及ABCG1的表达，从而可促进细胞内胆固醇的排出，减少胆固醇的聚集；StAR在体内的表达与年龄及血脂有一定联系。