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近年来兽药抗生素在畜禽养殖中大量使用。大部分抗生素未经代谢以母体化合物形式随粪便排出体外,并以粪肥的形式施入土壤,导致抗生素在土壤中积累,由此可能会诱导抗性微生物和抗生素抗性基因(ARGs)的产生,对人畜健康构成极大的潜在威胁。
本文选取长期使用氟苯尼考的养猪场为采样点,通过宏基因组学方法对土壤中的氟苯尼考抗性基因进行了筛选,主要获得了以下结果:⑴提取猪场土壤总DNA,利用限制性内切酶XhoⅠ和PstⅠ对基因组DNA进行双酶切,分别回收4-7 kb和2.5-4 kb片段。以pUC18质粒为载体,将双酶切后的DNA片段转化进宿主菌—E.coli BL21,构建了包含约2.5万个大片段克隆子和约1.5万个小片段克隆子的土壤宏基因组文库。⑵对获取的文库进行氟苯尼考抗性功能筛选,得到了约300个阳性克隆子。对其中的2株阳性克隆子进行插入片段测序,通过序列分析发现,其中一个片段含有一个编码转录调控激活因子SdiA的基因,该基因存在于多种大肠杆菌菌株中,主要参与AcrAB-TolC外排泵的正向表达调控,从而实现大肠杆菌的多重耐药性功能。另外一个片段包含一个未知的ORF以及3个目前已经被鉴定出的基因—编码Methylobacterium中反应调节受体蛋白的基因,编码Oligotropha carboxidovoransOM5菌株中异化扩散蛋白超家族(MFS)(Bcr/Clf亚族)的基因,编码Xanthobacterautotrophicus Py2菌株中短链脱氢酶SDR的基因,与这些基因的相似性都达到75%左右,其中的MFS蛋白具有质子泵功能,可以通过把抗生素排出细胞从而使细菌具有耐药性。本研究在国内首次通过构建宏基因组文库的方法成功筛选出猪场土壤中氟苯尼考的重组抗性菌株。对抗生素抗性基因的筛选,有助于深入了解环境中抗性基因的产生和传播途径,客观评价抗生素在环境中的生态风险。