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背景及目的随着发病率及死亡率的持续上升,癌症已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的健康问题。乳腺癌是女性中发病率最高的一种恶性肿瘤,全球每年有180万乳腺癌新发病例,死亡人数达到了40多万。据统计,在2015年全国新增癌症患者429万,其中有27万为乳腺癌患者。在最近几年中,乳腺癌的发病率正在以每年2.2%的增长率增长,严重的威胁着女性的健康。免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF)为一类具有调节细胞的运动、增殖、分化以及细胞-细胞、细胞-基质之间的粘附作用的细胞粘附分子。Embigin为一种跨膜糖蛋白,是免疫球蛋白超家族中的一员,参与了鼠的胚胎发育及器官的发育过程。Embigin由一个含有两个免疫球蛋白结构域的胞外区,一个含有29个氨基酸的跨膜区以及一个含有47个氨基酸的胞内区组成。近期有研究发现,embigin在一些癌细胞中异常表达,并可能在癌症的发生发展过程中扮演着重要的角色。HOXC8属于Hombox(HOX)蛋白家族的一员,具有转录因子的作用,参与了包括胚胎发育、细胞粘附、细胞凋亡、细胞迁移和肿瘤生成等过程的调控。在宫颈癌、前列腺癌以及乳腺癌中,HOXC8的表达水平均高于其在正常组织中的水平,并且在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。在我们实验室前期的研究中发现,HOXC8具有促进乳腺癌的发生和转移等作用。同时,也有报道指出,在鼠的胚胎成纤维细胞中HOXC8可以调控embigin的表达,但其具体机制尚不明确。因此,本文旨在研究HOXC8对embigin表达的调控机制及其在乳腺癌增殖和转移中的作用。内容及方法1.HOXC8对EMB表达的调控机制的研究(1)构建HOXC8过表达及敲低的乳腺癌细胞系,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印记(western blot)等实验,检测HOXC8过表达和敲低的细胞中embigin的mRNA和蛋白的水平。(2)构建Embigin启动子的荧光素酶报告载体,将其转入HOXC8过表达及敲低的乳腺癌细胞中,运用荧光素酶报告实验(Luciferase reporter assay)研究HOXC8是否是在转录水平上调控embigin的表达。(3)在HOXC8过表达和敲低的细胞中进行放线菌素实验,研究HOXC8是否是在转录后水平上调控embigin的表达。(4)分析Embigin启动子上可能的HOXC8结合位点,设计引物,运用染色质免疫共沉淀实验(Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP)确定HOXC8在embigin启动子上的结合位点。2.研究EMB在乳腺癌增殖和转移中的作用将embigin过表达载体和embigin shRNA载体转入乳腺癌细胞中,构建embigin过表达和敲低的乳腺癌细胞系进行：(1)MTT实验,检测EMB对乳腺癌细胞的增殖能力的影响；(2)软琼脂集落形成实验(Soft agar assay),检测embigin对乳腺癌细胞的非锚定依赖性生长能力的影响；(3)小室迁移实验(Transwell migration assay),检测embigin对乳腺癌细胞的迁移能力的影响。3.研究HOXC8调控乳腺癌增殖和转移的机制在已构建的HOXC8敲低细胞系中转染embigin shRNA载体,建HOXC8和embigin双敲低乳腺癌细胞系,并在这些细胞中进行：(1)MTT实验,检测HOXC8对embigin在乳腺癌增殖中的影响；(2)软琼脂集落形成实验(Soft agar colony formation assay),检测HOXC8对embigin在乳腺癌非锚定依赖性生长中的影响；(3)小室迁移实验(Transwell migration assay),检测HOXC8对embigin在乳腺癌细胞迁移中的作用的调控。结果1.HOXC8对embigin表达的调控机制的研究(1)过表达HOXC8降低了乳腺癌细胞中embigin的mRNA和蛋白水平,而敲低HOXC8增加了乳腺癌细胞中embigin的mRNA和蛋白水平。(2)过表达HOXC8的乳腺癌细胞中embigin启动子的荧光素酶活性降低了,而敲低HOXC8的乳腺癌细胞中embigin启动子的荧光素酶活性增加了。(3)放线菌素实验结果显示,过表达或敲低HOXC8对EMB的mRNA的稳定性没有影响。(4)用HOXC8抗体沉淀下来的DNA进行PCR,只有位于embigin启动子起始位点上游-2315到-2303的引物扩增出了条带,其余引物均没有扩增出条带,表明HOXC8结合在embigin启动子的-2315到-2303碱基的区域。2.研究embigin在乳腺癌增殖和转移中的作用(1)过表达embigin后乳腺癌细胞的增殖能力明显减弱,而敲低embigin增强了乳腺癌细胞的增殖能力；(2)过表达embigin后乳腺癌细胞形成的集落数明显减少,而敲低embigin明显增加了乳腺癌细胞形成的集落数；(3)过表达embigin的乳腺癌细胞迁移到Transwell小室下面的细胞数明显减少,而敲低embigin明显增加了迁移到Transwell小室下面的细胞数。3.研究HOXC8调控乳腺癌增殖和转移的机制(1)在乳腺癌细胞中敲低HOXC8,明显降低了细胞的增殖能力,而敲低embigin可以恢复HOXC8对乳腺癌细胞的增殖能力的影响；(2)在乳腺癌细胞中敲低HOXC8,减少了细胞形成的集落数,而敲低embigin可以恢复HOXC8对乳腺癌细胞集落生成能力的影响；(3)在乳腺癌细胞中敲低HOXC8,明显降低了迁移到Transwell小室下面的细胞数,而敲低embigin可以恢复HOXC8对乳腺癌细胞的迁移能力的影响。结论1.在乳腺癌细胞中,HOXC8结合到embigin的启动子上,并抑制了embigin的转录表达。2.Embigin的表达抑制了乳腺癌细胞的增殖、非锚定依赖性生长以及迁移能力。3.HOXC8通过调控embigin的表达调节乳腺癌的增殖和转移。