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第一部分OsEMF2b参与水稻花器官发育的调控途径研究EMBRYONIC FLOWER(EMF)是一个Polycomb-group protein(PcG)蛋白,其基因功能缺失使拟南芥植株未完成营养生长过程便快速进入生殖生长阶段,由于其植株没有积累足够的营养物质,导致拟南芥植株矮小,生殖生长阶段出现花器官不正常发育等现象。在拟南芥中,EMF2与EMF1构成PRC2蛋白通过H3K27me3的修饰方式调控花器官特异性基因表达。水稻中存在着两个EMF2的同源基因:OsEMF2a,OsEMF2b,其中OsEMF2b通过H3K27me3的表观遗传修饰来调控水稻花器官发育。研究表明,在拟南芥中,Chromomethylase3(CMT3)一个作用于CNG位点的DNA甲基转移酶,该酶仅仅在H3K27me3发生了 DNA甲基化,这暗示H3K27me3为DNA甲基化提供识别位点,进一步说明了 DNA甲基化参与了花器官发育的调控途径。为探究在水稻中DNA甲基化是否同样起到了辅助调控作用,本研究以OsEMF2b的T-DNA插入突变体为实验材料,通过农艺性状调查,芯片分析,实时荧光定量PCR,亚硫酸盐测序等实验得出结论:OsEMF2bT-DNA插入突变体植株发育情况较野生型相比花器官发育畸形,植株矮小、分蘖少,穗部分支少;其花器官发育不正常,各轮花器官均有不同程度的变异;经过基因芯片分析及荧光定量PCR验证后筛选出变化量较大的影响心皮发育的E族花器官特异性基因:OsMADS1和OsMADS6(与野生型中表达量相比分别下降了195.862倍,51.2921倍)和影响浆片发育的B族花器官特异性基因OsMADS2,OsMADS16(与野生型中表达量相比分别下降了 43.7661倍,14.6222倍)。分别取OsMADS1,OsMADS2为代表进行亚硫酸盐测序实验,OsMADS1基因中不存在DNA甲基化位点,在OsMADS2基因中虽然存在着甲基位点,证明有DNA甲基化的存在,但是野生型和突变体材料中的OsMADS2基因的甲基化位点相同,也就是证明OsEMF2b的改变对OsMADS2基因的DNA甲基化并没有产生影响,从而我们推测在OsEMF2b调控水稻花器官发育的过程中并没有DNA甲基化的参与辅助调控,继而推测出H3K27me3组蛋白甲基化修饰在水稻和拟南芥中的调控方式存在差别。在拟南芥中,染色质域解旋酶DNA结合蛋白3(CHD3)可以在H3K4me2,H3K27me3途径与PcG蛋白通过拮抗作用来调控拟南芥根的分生组织活性。在水稻中,CHR729(拟南芥CHD3蛋白的同源基因)也以H3K27me3的作用方式来改变基因的表达量。当该基因功能缺失时表现的性状与OsEMF2b突变体极为相似。为探究在水稻和拟南芥中是否存在着相同的蛋白互作模式,本实验通过酵母双杂交实验验证OsEMF2b与CHD3的同源基因CHR729之间产生没有直接的互作关系,所以推测拟南芥和水稻中的OsEMF2b的蛋白互作机制存在着差别,但需要进一步验证。第二部分DNA甲基化对非印迹基因表达的影响基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰,使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性,这种修饰常为DNA甲基化修饰,也包括组蛋白乙酰化,组蛋白甲基化修饰等。目前已有实验结果显示印记基因的表达受表观遗传学机制的调控,其中尤为显著的是DNA甲基化调控。然而非印记基因的表达调控方式目前仍没有确切的研究结果。动植物中存在两种DNA甲基化调控方式,一种是SNPs位点的表达不改变,另一种是仅表达亲本之一的SNPs位点。我们推测改变的SNPs位点表达可能与F1的杂种优势有关,同时发现非印记基因在不同发育时期可以发生印记的动态变化而成为印记基因,以上实验结果都显示出了 DNA甲基化参与了某些印记基因的表达。为了明确DNA甲基化是否在参与调控了印记基因表达的同时也调控了非印迹基因的表达,我们选择粳稻日本晴(Nip)和籼稻9311作为母本,通过正反交得到F1代种子,取F1代3-5天的种子的胚乳以及亲本的根、茎、叶作为实验研究材料。通过基因功能注释及文献资料查找,筛选出4个胚乳特异性非印迹基因,以这4个基因作为研究目标,通过DNA甲基化抑制剂5-azadC处理Nip和9311正反交的种子,检测以上四个非印迹基因的表达情况及SNPs位点变化情况,实验得出如下结论:被DNA甲基化抑制剂5-azadC(30μmol/L)处理后的粳稻日本晴与籼稻9311的F1代杂交种种子发芽速度慢,有部分植株慢慢枯萎死亡。且胚乳特异性基因表达部位发生改变,胚乳特异性基因便不再仅仅表达于胚乳中,也表达于叶片中。对4个非印迹基因进行扩增测序,发现其中两个基因变成了印迹基因,两个基因仍为非印迹基因。所以我们可以推测出在非印迹基因的表达中DNA甲基化起到了一定作用,进而可以推测DNA甲基化是印迹基因与非印迹基因的转换因素之一。