毕赤酵母(P.pastoris),甲醇营养型酵母,已经成为基因工程生产外源蛋白最重要的工具,与其他表达系统而言,具有很多优点,对于大肠杆菌表达系统而言,既具有操作简单、生产成本较低、外源蛋白高产量等优点,同时还具有蛋白的翻译后加工修饰作用;对于酿酒酵母而言,具有质粒表达的稳定性高、表达菌株较稳定、分泌效率较高等优点;对于哺乳动物表达系统而言,具有操作简单,培养基低廉,生产过程中不易污染的特点;对于昆虫细胞表达系统而言,具有成本显著降低的优点。基因的表达调控在蛋白表达过程中发挥重要的作用,基因表达分为DNA转录成RNA和RNA翻译成蛋白质。转录是基因表达的初始阶段,在这个阶段进行调控,对于生物来说是最为经济的。真核生物中,基因调控也是主要在转录水平上进行的。通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用实现了真核生物的转录调控。生物体基因调控主要发生在这些顺式作用元件上,如启动子、GC盒、CCAAT盒、增强子、沉默子、阻遏子等,最近发现起始密码子ATG周围碱基影响基因的转录效率,从而影响最终蛋白的产量。大量的实验结果表明起始密码子ATG周围序列对蛋白表达有不同程度的影响。Tatematsu,K.,et al.在2014年发表的文章中研究了家蚕中的起始密码子ATG周围的序列对重组蛋白表达量的影响。文章中比较了50种家蚕的自身基因,发现AAAAATCAAAATGG序列影响转录效率,之后他们利用EGFP和荧光素酶作为报告基因,构建了8种由不同的序列组成的质粒,这些序列长度为包括ATG在内的14个碱基,发现这些序列对基因转录和蛋白产量有显著影响,并且具有组织特异性。Dai,C.,et al.在2007年发表的文章中报道:他们将钾离子通道蝎毒素基因插入到p EGFP-N1真核表达载体的EGFP前面,并在融合蛋白的起始密码子ATG前插入了Kozak序列GCCACC,发现插入Kozak序列GCCACC使得融合蛋白的表达量大大升高,而未插入Kozak序列的基本上没有表达。Sano KI et al在2002年的文章中报道他们在荧光素基因以及龙虾原肌球蛋白的起始密码子ATG前面插入了龙虾原肌球蛋白c DNA的ATG前21个氨基酸,发现能显著的提高这两种蛋白的表达量。这些报道证明ATG周围序列对于基因的表达具有极大的影响,但是目前尚未有人对毕赤酵母AOX1启动子介导下毕赤酵母中ATG周围序列对基因表达的影响进行研究。本实验采用EGFP作为报告基因,构建了重组载体p PICZαA-EGFP,根据α信号肽序列和EGFP序列设计一对引物,在上游引物中引入PstⅠ限制性内切酶酶切位点,并在起始密码子ATG周围插入6个突变碱基,在大肠杆菌中使重组质粒得到大量扩增后电转化到毕赤酵母中,诱导转化子的表达,筛选阳性转化子,测定EGFP的表达量,经多次测序,得到ATG前面插入突变序列的阳性克隆数为77种;在ATG后面插入突变序列的阳性克隆数为48种后测序,记录插入的突变碱基的序列,接着我们使用RT-q PCR法对这些克隆的m RNA水平进行测定,综合分析ATG周围插入序列对EGFP转录水平的影响。实验结果表明:(1)在ATG前面插入6个碱基,显著增加EGFP表达量(荧光值变化率高于100%)的序列为CMSYMM;中等程度增加EGFP表达量(荧光值变化率在50-100%)的序列为RHSDYC;低程度增加EGFP表达量(荧光值变化率在0-50%)的序列为CMBNCB;降低EGFP表达量(荧光值变化率为负值)的序列为KWBKTN。(2)在ATG后面插入6个碱基,明显增加EGFP表达量(荧光值变化率高于100%)的序列为BHYRAS;中等程度增加EGFP表达量(荧光值变化率在50-100%)的序列为ASBRWY;低程度增加EGFP表达量(荧光值变化率在0-50%)的序列为NHCVND;降低EGFP表达量(荧光值变化率为负值)的序列为WARRBV。(3)m RNA表达量的高低基本上与在ATG周围插入序列的EGFP荧光强度变化一致,这说明,在ATG周围插入的序列是通过影响了EGFP的转录,使得m RNA的表达量发生了改变,从而影响蛋白质的最终产量。