Slit-Robo信号通路是一条广泛存在于从果蝇到人类几乎所有动物种类的古老信号通路。大量研究表明它参与动物体内多种生理与病理过程。2008年Dickinson等首次发现,Slit-Robo在人类成年卵巢有表达。本研究组的李江超在利用Robo1/2联合单敲(单等位基因敲除)小鼠进行肿瘤病理学研究的过程中发现,与野生型小鼠相比,Robo1/2联合单敲的小鼠的产仔率显著提高,强烈提示Slit-Robo信号通路与哺乳动物的生殖能力紧密相关。有关Slit-Robo信号通路对哺乳动物的生殖能力的影响鲜见文献报道。在本研究中,我们系统对比了Robo1/2联合单敲小鼠与野生型小鼠的卵巢大小、卵巢重量以及始基卵泡数量,并通过体外受精的方法全面比较了两组小鼠的卵母细胞存活状况、受精状况以及早期胚胎发育状况。同时,我们采用人类颗粒细胞siRNA干扰Robo1/2基因的方法观察了Robo1/2基因对人卵丘颗粒细胞凋亡状况的影响,为探索基于Robo基因干预人类生殖保护的新方法提供理论依据。1993年,Seeger等首次在于果蝇体内发现Robo基因是一个跨膜受体的编码基因。1999年,科学家们发现,在果蝇体内Slit蛋白是Robo受体的配体,并且发现在神经系统的发育过程中,Slit-Robo之间的相互作用在轴突导向方面起着进化保守的作用。以后的大量研究表明,Slit-Robo信号通路在机体的各个组织、各项功能中发挥着重要作用。Robo蛋白(亦称Robo受体)是一种跨膜蛋白受体,由Robo基因因编码,在哺乳动物体内Robo受体共分为4种,即Robo1,2,3,4[4,5]。Robol-3受体由5个Ig功能区、3个纤维黏连蛋白功能区、1个跨膜片段和1个胞内片段组成,其中胞内片段为4个保守的模体,即CCO, CC1, CC2, CC3[6]。Robo4与上述受体类型不同的是只有2个Ig功能区,其余部分一致。Robo1和Robo2在成熟个体的多数组织和器官中均有表达,但主要表达在发育中的神经系统,Robo3只表达于发育中的中枢神经系统,而Robo4则表达于内皮细胞中。Slit蛋白是Robo受体的配体,它由富亮氨酸重复序列、表皮生长因子样重复序列、1个层黏连蛋白G-样区域和1个C-末端半胱氨酸构成。哺乳动物Slit蛋白分为3种亚型,即Slit1、Slit2和Slit3, Slitl仅存在于神经系统,Slit2和Slit3除了存在于神经系统外亦可表达于其它的细胞类型,如心脏、血管等。Slit配体通过N端的D2(第二亮氨酸重复区)区与Robo受体的Ig1-2结合,硫酸乙酰蛋白聚糖能稳定Slit-Robo,形成Slit-Robo-Heparin复合体。Slit-Robo家族参与了多种生理和病理过程,包括：(1)神经系统轴突导向作用；(2)参与血管形成,调节成熟血管的功能；(3)调控哺乳动物心脏腔室形态的发生过程；(3)调控肌细胞生成,白细胞趋化反应以及血管平滑肌的迁移；(4)可以激活细胞凋亡蛋白,参与诱导细胞凋亡。近年来有关Slit-Robo信号通路的研究多集中在肿瘤领域,Slit和Robo之间通过相互作用来调节肿瘤发展过程中的关键环节,包括肿瘤浸润、转移、血管生成以及凋亡。但是有关Slit-Robo信号通路对肿瘤的作用还存在争议,大多数的研究表明,Robol (3p12), Slit2(4p15.2), Slit3(5q34-35)以及Slitl(10q23.3-24)已成为肿瘤抑制基因候选基因,对其进行敲除或者进行启动区域甲基化可以抑制人类肿瘤(包括颈椎肿瘤等)。但是与之相反的是,王彪等在多个肿瘤细胞中未发现Slit2高表达,并且发现肿瘤细胞能够分泌Slit2,它可以结合血管内皮细胞上的Robol受体,吸引血管内皮细胞向肿瘤内迁移,从而诱导肿瘤的新生血管形成,并促使肿瘤快速生长,通过Robol胞外区的特异性抗体R5阻断Slit2/Robol信号,则可使肿瘤血管密度明显降低和肿瘤体积显著缩小。2008年,Dickinson等首次发现,Slit-Robo信号通路存在于人类成年卵巢中。并且在随后的研究中发现,在卵巢的发育过程中Slit-Robo信号通路的受体水平能够伴随卵巢的发育得以调节,并且在卵泡发育阶段Robo基因表达上调,Robol主要表达于卵泡的前颗粒细胞,少量表达于卵母细胞,Robo2、Robo4和Slit2表达于发育中始基卵泡中的卵母细胞。在卵巢的发育过程中,Slit-Robo信号通路存在于卵泡形成阶段。当Slit-Robo表达上调时,处于增值状态的卵母细胞的数量反而显著降低。上述研究揭示,Slit-Robo可能与哺乳动物卵巢储备的调控相关。这是目前仅见于文献报道的关于Slit-Robo信号通路与卵巢储备相关性的研究,关于Slit-Robo信号通路对生殖力的具体影响尚未见相关报道。颗粒细胞在整个生殖系统中发挥着十分重要的作用,它位于卵巢中卵母细胞透明带周围,以缝隙连接的方式与卵母细胞相连,发挥着重要的支持和保护卵母细胞的作用,影响卵母细胞的发育。Host等研究证明,卵丘颗粒细胞凋亡与卵母细胞成熟、单精子胞质内显微注射后成熟卵母细胞受精状况以及胚胎评分状况相关。Raman等的研究也说明,卵丘颗粒细胞的凋亡状态与卵子的发育潜能相关。Dickinson等的研究表明,Slit-Robo通过增强细胞凋亡以及上调caspase-3来参与小鼠黄体的生成,Robo1和Robo2表达于黄体颗粒细胞和黄体纤维样细胞,阻断Slit-Robo信号通路可以增强黄体细胞迁移,减少凋亡。目前,尚无有关Slit-Robo信号通路与卵丘颗粒细胞的关联性研究。在本研究中,我们利用基因联合单敲观察Robo1/2基因对小鼠卵巢大小和重量、始基卵泡数量、卵母细胞存活状况、卵母细胞受精能力及早期胚胎发育潜能等的影响；利用siRNA干扰的方法观察Robo1/2联合基因沉默对人类卵丘颗粒细胞凋亡状况的影响。初步研究了Robo1和Robo2基因对生殖力的影响,为建立基因生物靶向的女性生殖保护进行了前期探索。研究目的1.研究Robo1/2联合单敲对小鼠卵巢发育和卵巢储备的影响；2.研究Robo1/2联合单敲对小鼠卵母细胞存活状况、受精能力及其早期胚胎发育潜能的影响；3. Robo1/2联合基因沉默后,人类卵丘颗粒细胞的凋亡状况。研究方法1.小鼠体外受精及胚胎培养实验：实验组为Robo1/2联合单敲母鼠,对照组为野生型(Wild Type, WT)母鼠,配种公鼠为WT小鼠,排除因公鼠个体差异对精子质量的影响,针对母鼠进行超排卵,首先腹腔注射10IU的PMSG,48小时后再腹腔注射1OIU的hCG,于hCG注射后10-16小时,颈部脱臼处死母鼠,打开腹部,将母鼠的生殖器官全部取出,分离卵巢和输卵管,在体视镜下操作,获得卵母细胞-卵丘复合物,然后进行体外受精,胚胎培养,通过观察其受精及胚胎发育状况,比较实验组和对照组母鼠的卵母细胞受精能力及胚胎发育潜能,于此同时,观察和测量Robo1/2联合单敲母鼠的左侧卵巢大小、重量和组织学特征。2.人类卵丘颗粒细胞鉴定：收集在广东省人民医院生殖医学科进行辅助生殖技术治疗的、符合纳入标准的不孕患者的卵丘颗粒细胞,采用镜下采集、PBS洗涤、透明质酸酶消化、高糖DMEM培养等方法,进行人类卵丘颗粒细胞的采集和培养,与此同时进行鉴定,鉴定方法包括镜下观察、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色、促卵泡生成素受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)兔抗人多克隆抗体免疫组化染色,细胞增殖能力检测(CCK-8法)。3. Robo1/2联合基因沉默：将培养的卵丘颗粒细胞分为三组,即siRNA干扰组(即实验组)、Mock组和空白对照组,于卵丘颗粒细胞培养后24h进行干扰,干扰后24h换液,继续培养24小时后胰酶消化,获得颗粒细胞。4. Western Blot:提取实验组、Mock组和空白对照组中颗粒细胞的蛋白质,检测其中Robo1/2蛋白的表达。5.流式细胞凋亡检测：人卵丘颗粒细胞siRNA干扰后,继续培养24h,胰酶消化,获得颗粒细胞,上机前标记抗体(采用Annexin V/PI凋亡检测试剂盒),在流式细胞仪上进行细胞的凋亡检测。结果1. Robo1和Robo2基因联合单敲对小鼠卵巢发育的影响：通过对Robo1和Robo2基因联合单敲母鼠和野生型母鼠的左侧卵巢大小、重量和卵巢切片,我们发现,与野生型小鼠相比,Robo1和Robo2基因联合单敲母鼠的卵巢大,卵巢重量显著增高,卵巢组织切片中始基卵泡的数量偏多。这说明,Robo1和Robo2基因联合单敲有利于卵巢发育和卵巢储备。2. Robo1和Robo2基因联合单敲对小鼠卵母细胞存活状况、受精能力及早期胚胎发育潜能的影响：与对照组相比,实验组卵母细胞存活率、受精率和6-8细胞胚胎形成率均有所增加,但无统计学意义,这说明Robo1/2联合单敲可能有利于小鼠的卵母细胞质量,受精能力和早期胚胎发育,但影响并不显著。3.人卵丘颗粒细胞分离、原代培养及鉴定：(1)镜下观察：颗粒细胞培养6-8h后开始贴壁生长,状态良好,但生长速度较慢,于2d达到增殖高峰,细胞之间以丝状突起连接,于5-7d后细胞开始纤维样变形,随后逐渐退化死亡；(2)HE染色：人卵丘颗粒细胞形态正常,成梭形或星形,边界不规则且明显,大小均一,细胞核染色显著,较大,呈椭圆形或圆形,核仁显著深染,细胞质染色较浅,透光性好,边界清楚,内含丰富的空泡样结构,细胞表面存在深染的颗粒样物质,细胞存在轴突样结构,细胞中间以丝状轴突相互连接；(3)CCK-8法测定卵丘颗粒细胞增殖曲线：颗粒细胞6h后开始贴壁生长,于2d达到增殖高峰,6-7d细胞开始较为快速地退化；(4)FSHR兔抗人多克隆抗体免疫组化染色：人卵丘颗粒细胞胞浆呈棕褐色,核仁蓝色,特异性较为显著。4. Robo1/2联合基因沉默：转染后24h镜下观察发现,Mock组颗粒细胞变圆,收缩,细胞间距变大,细胞表面有较多黑色颗粒状物质,培养液中有漂浮的细胞,实验组、空白对照组组细胞生长状况正常。三组细胞中,Mock组的细胞凋亡较为严重,这表示转染试剂具有一定的细胞毒性,Robo1/2联合基因沉默可能会减少人卵丘颗粒细胞凋亡。5. Western Blot分析：与空白对照组和Mock组相比,实验组Robo1和Robo2条带均减弱,说明已经成功干预了人卵丘颗粒细胞中Robo1和Robo2蛋白的表达,siRNA转染后,实验组Robo1和Robo2蛋白表达降低。6.流式细胞凋亡检测：与Mock组相比,实验组人卵丘颗粒细胞的凋亡率显著降低,存在统计学差异,而实验组与空白对照组之间的凋亡率不存在统计学差异。以上结果说明转染试剂对人卵丘颗粒细胞有一定的细胞毒性作用,能够促进细胞的凋亡,当进行Robo1/2转染后,细胞可能有一定的抗凋亡作用。结论1. Robo1/2联合单敲可能有利于小鼠卵巢发育和卵巢储备；2. Robol/2联合单敲可能对小鼠卵母细胞质量以及其受精能力和胚胎质量没有显著影响；3. Robo1/2联合基因沉默可能有利于降低人卵丘颗粒细胞的凋亡。