论文部分内容阅读
研究目的:1、观察肺腺癌A549细胞和肺腺癌A549干细胞球线粒体内Drp1、cAMP-PKA-Drp1通路和细胞凋亡相关蛋白表达情况。2、研究肽核酸-三苯磷(peptide nucleic acids-triphenylphosphine,PNA-TPP)对肺腺癌A549干细胞球能量代谢、Drp1线粒体内转运水平、活性氧以及顺铂化疗敏感性的影响。方法:1、采用无血清培养基(serum free medium,SFM)的方法培养出A549干细胞球。2、使用固相肽的方法合成PNA-TPP,然后采用Western-blot法检测PNA-TPP转染对A549干细胞球内PKA-Cα、线粒体内Drp1和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平影响,并同时观察PNA-TPP联合顺铂处理对A549干细胞球的Bcl-2和Bax的表达影响。3、ATP试剂盒检测PNA-TPP转染A549干细胞球后细胞内ATP水平。4、过表达和干扰Drp1的慢病毒转染A549干细胞球后,荧光显微镜下观察转染情况,Western-blot法验证转染效率并筛选出最佳干扰片段。5、DHE-ROS试剂盒检测并在荧光显微镜下观察PNA-TPP或慢病毒转染A549干细胞球后细胞内ROS水平。6、CCK-8检测PNA-TPP转染和或联合顺铂处理后A549干细胞球的增殖水平,以及过表达或干扰Drp1后A549干细胞球的细胞增殖情况。7、使用流式细胞仪技术,Annexin V-APC/PI双染检测PNA-TPP转染和或联合顺铂处理后A549干细胞球的凋亡水平,以及过表达或干扰Drp1后A549干细胞球的细胞凋亡情况。结果:1、SFM法成功培养出A549干细胞球,倒置相差显微镜观察到每个球内有几百到上千个细胞,且透光性较好。2、与A549细胞相比,A549干细胞球内PKA-Cα蛋白表达升高,线粒体内Drp1蛋白表达降低,凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低。3、成功合成的PNA-TPP复合物,经鉴定为检测为单峰,且未见其他杂质峰,纯度良好。4、PNA-TPP转染A549干细胞球后,与空白对照组相比,PNA-TPP组PKA-Cα蛋白表达降低,线粒体内Drp1蛋白表达升高,细胞内ATP含量降低、ROS水平升高,细胞增殖能力减弱,细胞凋亡增多。与空白对照组相比,PNA-TPP组凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达无明显变化;而与PNA-TPP或CDDP单独处理组相比,PNA-TPP联合CDDP处理组Bcl-2蛋白表达减低,Bax蛋白表达升高,且细胞增殖能力减弱,细胞凋亡增多。5、A549干细胞球中,过表达Drp1后细胞内活性氧水平升高,细胞增殖能力减弱,细胞凋亡增多;反之,干扰Drp1则可降低细胞内活性氧水平,细胞增殖能力增强,减少细胞凋亡。结论:1、肺癌A549干细胞球具有较A549细胞更低的线粒体分裂水平,以及更强的抗凋亡能力。2、PNA-TPP抑制A549干细胞球ATP产生,可能部分通过下调PKA-Cα水平,增加Drp1向线粒体转运,促进线粒体分裂和ROS产生,进而促进细胞凋亡,增强顺铂的化疗敏感性。