目的：　　 创伤后应激障碍(post traumatic stress disorder,PTSD)是对刺激因素的一种异常精神反应。尽管进行了大量的神经生物学研究,但目前对PTSD的发病机制还不是十分清楚。PTSD临床表现多样,主要包括创伤经历再体验、情感麻木与回避行为、警觉增高所致易激惹症状三大症候群。这些症状表明PTSD患者可能血中皮质醇水平增高的现象。然而,大量研究表明PTSD患者血中皮质醇水平比正常人低。目前,在其他抑郁症的患者中主要存在皮质醇负反馈的抑制,PTSD患者却有负反馈增强的现象。　　 大脑的前额内侧皮质(mPFC)是PTSD患者的关键脑区,包括前扣带回(ACC),缘下回(IL)、边缘前皮质(PL),在灵长动物此区与杏仁核联系密切,涉及恐惧的消退和恐惧的表达过程。当mPFC受损时恐惧消退不能,PTSD患者呈现持续的不适恐惧并且在实验室条件下条件恐惧的消除减低,说明在PTSD患者存在mPFC功能低下,影像学研究证实此区体积减少,神经元完整性不全。　　 细胞凋亡(apoptosis),又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath,),是由一系列生理和病理刺激引起的。在细胞凋亡的线粒体途径中,主要是细胞色素C从线粒体膜上释放到了胞浆中,导致Caspases级联放大信号系统的激活。细胞色素C进入胞浆中,首先活化Caspase-9,Caspase-9再酶解Caspase-3前体,从而活化Caspase-3,最终引起染色体DNA的降解和细胞的解体。目前已经报道PTSD患者mPFC体积减小,以及单一连续应激(singleprolongedstress,SPS)导致杏仁核神经元的凋亡。PTSD患者mPFC神经元是否存在凋亡,是否导致了mPFC功能的异常。　　 皮质类固醇受体包括糖皮质激素受体(GR,Ⅰ型),和盐皮质激素受体(MR,Ⅱ型)。MR是高亲和力和低容量的糖皮质激素受体系统,而GR.和高容量的糖皮质激素受体系统。GR在应激后糖皮质激素的生理上升期不断被占领结合。两种受体的平衡对应激反应和行为学适应发挥重要的作用。糖皮质激素通过GR,MR介导的两种反馈模式使HPA轴处于适当的水平。在这个过程中,可以认为皮质醇受体起到了一种转录因子的功能。受体数量,亲和力以及在应激反应中的功能不同,导致不同个体血中皮质醇激素水平的不同,产生不同的生物学行为。目前对PTSD的病人和相关动物模型都观察到了GR,MR的改变。　　 实验方法：　　 1、模型制作及分组　　 采用日本文部省召开的“基础和临床的研究进展”的会议确定的关于PTSD模型-SPS刺激。SPS刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理,即:大鼠禁锢2h后,立即强迫游泳20min(水深40em,水温25℃)。经过15min的恢复,乙醚麻醉至意识丧失,在笼子中不再经任何刺激正常饲养至取材。随机分为5组,对照组、SPS后无干扰地静养1d、7d,14d和28d组,其中检测凋亡的分为SPS后1d、4d、7d、14d组。　　 2、mPFC的GR,MR,Caspase-3免疫组织化学方法　　 分别选取各组大鼠灌流固定、石蜡包埋大脑,制作石蜡切片,分别用SABC法进行mPFC的GR,,MR,Caspase-3免疫组织化学染色(工作浓度:GR:1:800,MR,1:300,Caspase-3,1:300),DAB显色,中性树胶封片,光学显微镜观察,摄片。　　 3、mPFC的Caspase-9免疫荧光染色方法　　 石蜡切片用PBS漂洗10min×3,5%BSA封闭20rain后,滴加鼠单克隆抗体Caspase-9,0.01mol/LPBS代替一抗作阴性对照,4℃孵育过夜,滴加FITC标记的羊抗鼠.1gG湿盒中37℃孵育30min,甘油封片,荧光显微镜观察并摄片。　　 4、Westernblotting检测mPFC的GR,MR　　 分别取新鲜mPFC的组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心,提取上清蛋白,电泳,转膜,经封闭后分别加一抗MR和GR(MR工作浓度1:500,GR工作浓度1:1000)4℃过夜;HRP标记IgG(工作浓度1:1500)孵育2h,DAB法显色,扫描各条带计算光密度值。　　 5、RT-PCR检测mPFC的GR,MR,Caspase-3,Caspase-9　　 断头取脑分离mPFC,提取总RNA,进行逆转录和PCR扩增。扩增结束后进行凝胶电泳,成像并进行积分光密度分析。　　 结果：　　 1、mPFC的GR,MR,Caspase-3免疫组织化学方法染色的结果　　 Caspase-3分布于神经元的胞体,SPS-1d组、SPS-4d组和SPS-7d组与对照组相比,Caspases-3的阳性表达逐渐增强,SPS-14d组Caspase-3的阳性表达下降。　　 高倍镜可见GR分布于神经元的胞核,SPS-1d组与对照组相比,GR的阳性表达增强,但无统计学意义。SPS-7d组与SPS-14d组GR的阳性表达明显增强,于SPS-14d到达高峰,SPS-28d表达下降,但仍然高于对照组。　　 高倍镜可见MR分布于神经元的细胞质中,SPS-1d组与对照组相比,MR的阳性表达明显增高,SPS-4d组与SPS-7d组MR的表达逐渐降低,于SPS-14d组降低到最低,SPS-28d组的表达略有增强,到仍然低于对照组。　　 2、mPFC的Caspase-9免疫荧光染色方法结果　　 Caspase-9阳性反应细胞在对照组和SPS后各组中均有表达,呈绿色荧光,胞体,胞膜和突起均有着色。　　 3、Westernblotting检测mPFC的GR和MR的结果　　 GR的分子量87kb,结果显示SPS后1d大鼠mPFCGR的表达上调,但与对照组相比无明显区别,SPS-7d和SPS-14d表达逐渐增强,在SPS-14d到达顶峰,SPS-28d虽有降低,但表达仍然高于对照组。　　 MR的分子量分别为112kb,结果显示SPS后1d大鼠mPFCMR增强,SPS-7d和SPS-14d组MR下调,SPS-28组MR的表达恢复性增强,但低于对照组。　　 4、RT-PCR检测mPFC的GR、MR、Caspase-3、Caspase-9的mRNA结果　　 与正常对照组相比,SPS后1d、4d、7d大鼠mPFC的Caspase-3的表达逐渐上调,14d恢复性下调。Caspase-9于SPS-4d达到顶峰,SPS-7d组和SPS-14d组表达逐渐下降。　　 GR在mPFC表达,以β-actin作为内参照,对各组条带进行分析。与正常对照组相比,SPS后1d、7d和14d大鼠mPFC的表达逐渐上调,SPS-28d表达恢复性下调。　　 MR在mPFC表达,以β-actin作为内参照,对各组条带进行分析。与正常对照组相比,SPS后1d增强,此后MR表达下调,SPS-7d和SPS-14d组MR表达下调。　　 结论：　　 1、PTSD大鼠SPS刺激后mPFC神经元出现了线粒体途径的细胞凋亡,mPFC神经元细胞凋亡可能是导致PTSD患者mPFC体积减小、功能下降的原因之一。　　 2、PTSD模型大鼠SPS处理后,mPFC中可出现GR、MR的表达。　　 3、mPFC神经元GR、MR的表达变化可能参与PTSD的HPA轴的变化机制。