目的:肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)被广泛认为是一个关键的肿瘤抑制基因,其突变失活能够引起人类多种疾病发生。LKB1基因的突变也是肿瘤发生的重要原因。我们前期研究发现,人端粒酶mRNA(hTERC)的异型扩增在肺癌及癌前期病变患者支气管刷检细胞中的表达明显增高,并与病变的严重程度呈正相关;LKB1和hTERT的表达成反比,且可以通过SP1的磷酸化下调hTERT的蛋白及mRNA的表达。然而,在肺癌细胞中,LKB1与hTERC的表达是否存在上下游的调控关系以及hTERC的异型扩增究竟受哪些基因调控目前均不清楚。如果LKB1与hTERC之间存在调控关系,那么LKB1是如何影响hTERC的mRNA表达及异型扩增,其详细的分子机制仍需要具体阐明。Yes相关蛋白(YAP)是Hippo信号通路下游的关键效应分子,通过磷酸化形式调节细胞核内外的信号传递;作为转录共激活因子调节靶蛋白转录因子的活性。已有研究表明在胃癌中LKB1可通过磷酸化YAP来调控其转录激活活性,以限制组织过度生长;Nguyen HB等认为在宫颈癌中LKB1可以磷酸化YAP使之出核,然而在肺癌细胞中是否也存在着调控关系目前尚未见报道。众所周知,端粒随着体细胞不断增殖而逐渐缩短,当细胞端粒缩至一定程度,细胞停止分裂,处于静止状态。端粒长短及稳定性决定了细胞寿命,并与细胞衰老和癌变密切相关。端粒酶是一个核蛋白酶复合体,具有合成端粒序列和平衡端粒的消耗能力的功能,其中人端粒酶mRNA成分(hTERC)是端粒延长的RNA模板,是端粒酶活动必须的核心组分之一,对于端粒酶的结构和活性都是十分重要的。我们前期研究发现在肺癌患者支气管刷检细胞和胸水细胞中hTERC及hTERT基因均有明显异型扩增,而在绝大多数正常的体细胞中异型扩增极为少见。因此,全面理解并且掌握肺癌细胞中hTERC的异型扩增及具体的调控机制,可为开发全新的肿瘤靶向药物提供了新的研发方向,并且为临床的诊疗提供新的思路。Yu P等研究表明在乳腺癌中YAP是促进hTERT表达的关键因素之一,然而YAP是否可以调控hTERC的转录表达及异型扩增目前尚需进一步阐述。综合我们的前期研究成果及近年来国内外相关报道,我们推测在肺癌细胞中,LKB1可通过磷酸化YAP,促使pYAP滞留在胞浆中,从而抑制YAP入核发挥转录共激活作用,进而失去上调hTERC的表达及异型扩增的能力。研究方法:首先我们用蛋白免疫印迹(Western blotting)的方法检测肺癌细胞系及正常支气管上皮细胞中的LKB1的表达情况;然后采用转染及干扰技术双向调控LKB1后,应用Western blotting、定量即时聚合酶链锁反应(qRT-PCR)检测LKB1、YAP的蛋白和mRNA的表达变化,p-YAP蛋白的表达变化,hTERC mRNA的表达变化;采用核浆分离实验和Western blotting实验检测LKB1蛋白对YAP,p-YAP蛋白核浆的表达情况;采用免疫荧光来检测LKB1蛋白对YAP蛋白核浆分布的影响;采用荧光原位杂交法检测干扰YAP后hTERC的异型扩增,同时用Western blotting和qRT-PCR实验检测干扰YAP后,YAP蛋白、p-YAP蛋白的表达情况,以及YAP mRNA,hTERC mRNA的表达情况;采用SPSS22.0统计分析软件对实验数据进行t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.LKB1蛋白在肺癌细胞系中低表达。首先我们采用蛋白免疫印迹的方法检测了LKB1蛋白在3种肺癌细胞系(NCI-H460、A549、LK2)以及正常支气管上皮细胞(HBE)中的表达情况。我们发现LKB1蛋白在肺癌细胞系中的表达低于其在正常支气管上皮细胞中的表达。肺癌细胞系中,在NCI-H460中表达较高,而在A549和LK2细胞系中表达较低。鉴于此结果,我们选择A549及LK2两种细胞系转染了LKB1表达质粒,而在NCI-H460细胞系中采用SiRNA干扰其内源LKB1的表达。2.LKB1上调p-YAP并且抑制hTERC的表达。我们将pcDNA3-LKB1-His瞬时转入低表达LKB1的A549和LK2中,与对照组相比,过表达LKB1上调了p-YAP的蛋白表达并且抑制了hTERC的mRNA的表达,而YAP的mRNA及蛋白表达没有改变。3.沉默LKB1下调p-YAP,上调hTERC的表达。在NCI-H460细胞中干扰掉内源性LKB1后,与对照组相比,p-YAP明显下调,hTERC mRNA升高,同时YAP蛋白也明显上调,但YAP mRNA表达没有改变。4.LKB1可以促进YAP的核排斥。为了确定YAP的定位是否与LKB1的调节有关,我们用Western Blotting来检测YAP,p-YAP在核浆的表达情况。并且用免疫荧光来检查YAP的亚细胞表达情况。转染LKB1后,细胞浆中的p-YAP表达明显提高,YAP提高。细胞核中的YAP明显下降,而p-YAP几乎检测不到。干扰LKB1后,细胞浆中的p-YAP表达明显下降,YAP下降。细胞核中的YAP明显提高,而p-YAP几乎检测不到。然而转染和干扰LKB1后YAP的mRNA基本没有,因此我们推测LKB1磷酸化YAP从而抑制其入核。同时我们用免疫荧光实验来验证这一推测。免疫荧光结果显示,当转染LKB1后,我们可以看出YAP在胞浆中表达量明显提高。干扰LKB1后,我们看到YAP在核中表达比较高。5.干扰YAP,抑制hTERC的异型扩增。干扰YAP后,我们发现hTERC的mRNA明显下降,同时抑制了hTERC的异型扩增。我们怀疑LKB1是通过磷酸化YAP从而抑制了hTERC的表达以及异型扩增。因此,我们用Western blotting检测了干扰YAP后的YAP以及p-YAP表达情况。我们发现p-YAP表达基本无变化,而YAP表达明显下降。结论:1.在肺癌细胞中,LKB1能够抑制hTERC mRNA的表达。2.LKB1能够磷酸化YAP,从而促进YAP出核停留在细胞浆中,进而抑制其转录激活活性。3.在肺癌细胞中,YAP可促进hTERC的表达和异型扩增。